Ⅲ.粘性放线菌菌毛粘附与凝集活性的研究

摘要　目的:了解粘放菌两种菌毛在粘附牙面和与血链球菌34凝集中的生物活性。方法:采用粘放菌Ⅰ型和Ⅱ型菌毛提取物及两种抗菌毛抗体,通过它们对粘放菌粘附唾液包被的羟磷灰石(SHA)的抑制实验来判断两种菌毛的粘附活性,通过粘放菌与血链球菌34的凝集实验及两种抗菌毛抗体对凝集反应的抑制实验来确定两种菌毛的凝集活性。结果:①粘放菌Ⅰ型和Ⅱ型菌毛提取物及两种抗菌毛抗体均能抑制粘放菌对SHA的粘附;②只有Ⅱ型菌毛能间接引起肉眼可见的血链球菌34的凝集反应,抗Ⅱ型菌毛抗体能抑制凝集反应,抗Ⅰ型菌毛抗体无此抑制作用。结论:Ⅰ型和Ⅱ型菌毛均有粘附性能;Ⅱ型菌毛有凝集性能,Ⅰ型菌毛无凝集性能;本课题所采用的菌毛分离法未破坏菌毛的生物活性。
关键词　粘性放线菌　菌毛　粘附　凝集

　　菌斑是导致口腔内两大常见病——龋病和牙周病的始动因子。粘性放线菌(以下简称粘放菌)是菌斑的主要成员。许多研究结果表明［1,2］,粘放菌的致病作用与其表面菌毛有关。粘放菌有两种功能及抗原性均不同的菌毛:Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛。它们在粘放菌粘附到牙面和凝集一些链球菌的过程中起着非常重要的作用［2,3］。因此,本实验目的旨在了解粘放菌两种菌毛在粘附牙面和与血液链球菌34(简称血链球菌34)凝集中的生物活性。

1　材料和方法

1.1　实验菌株及培养条件
　　粘放菌5519(1+2-)、5951(1-2+)、T14V(1+2+)和血链球菌34均由上海第二医科大学口腔医学研究所刘正教授惠赠。
　　粘放菌的培养条件见参考文献［4］。血链球菌34的培养条件与粘放菌相同。
1.2　抗体的制备
　　制备抗体参见参考文献［5］,并采用DEAE-纤维素层析法分别提取抗Ⅰ型菌毛IgG和抗Ⅱ型菌毛IgG。
1.3　菌毛对粘放菌粘附唾液包被羟基磷灰石(SHA)的抑制
1.3.1　菌毛的制备　制备菌毛参见参考文献［4］。分别取两种菌毛提取过程中三个阶段的提取物:上清粗提物、20%硫酸铵沉淀物和纯化菌毛。用KCl缓冲液调节蛋白浓度,均为1.0 mg/ml(考马斯亮蓝法测定)。
1.3.2　唾液的收集　不加任何刺激物的条件下,取一志愿者的全唾液,室温下,10000 r/min离心10分,取上清,备用。
1.3.3　粘附抑制实验　40孔酶标板,每孔称取4 mg羟基磷灰石(HA),KCl缓冲液浸泡过夜。空白对照组加入KCl缓冲液(100 μl/孔)。实验组和阳性对照组加入全唾液(100 μl/孔),室温下旋转1小时,形成SHA。KCl缓冲液洗涤2次。加入含5 mg/ml牛血清白蛋白的KCl缓冲液100 μl/孔,旋转1小时以封闭唾液未覆盖的HA表面。洗涤后,实验组分别加入上述两种菌毛三个阶段提取物的蛋白溶液(100 μl/孔)。旋转1小时,洗涤2次后,实验组、阳性对照组、空白对照组分别加入3H-胸苷标记的细菌5519、5951(OD540 nm=0.4,100 μl/孔),旋转1小时,洗涤3次,将HA转入闪烁瓶,闪烁计数。所有实验均重复两次,取均数。计算粘附相对百分率及粘附抑制率。
1.4　抗体对粘放菌粘附SHA的抑制
　　实验方法同1.3.3。先形成SHA。每孔分别加入3H-胸苷标记的三种菌液(5519、5951、T14V)(OD540 nm=0.8,50 μl/孔),再分别在各孔中加入三种抗体:抗Ⅰ型菌毛IgG(即αⅠIgG,50 μl,50 μg/ml),抗Ⅱ型菌毛IgG(即αⅡIgG,50 μl,50 μg/ml),αⅠIgG和αⅡIgG(各25 μl,50 μg/ml)。以上实验均重复2次,取均数,计算粘附抑制率。
1.5　菌毛介导血链球菌34的凝集
1.5.1　菌毛的制备　菌毛制备见参考文献［4］。取纯化的Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛,用凝集缓冲液(5 mmol/L磷酸钾盐,0.1 mmol/L CaCl2,50 mmol/L NaCl,pH8.0)调节蛋白浓度,均为1 mg/ml(考马斯亮蓝法)。
1.5.2　凝集实验　直接凝集实验:各取两种菌毛溶液25 μl于清洁玻片上,分别加入25 μl血链球菌34(OD650 nm=1.0),室温下充分混匀,放置30分～1小时,肉眼观察结果并记录。
　　间接凝集实验:各取两种菌毛溶液25 μl于清洁玻片上,分别加入10 μl抗5519抗血清和抗5951抗血清,混匀数分钟后,分别加入25 μl血链球菌34,充分混匀,放置30分～1小时,肉眼观察结果并记录。

责任编辑：姚红祥