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1.4.2 分子量测定 Tricine-SDS-PAGE参照Schagger等［4］的方法进行,浓缩胶浓度为4%,分离胶浓度为16.5%,于100 V恒压电泳3.5 h,考马斯亮蓝R250染色。
1.4.3 蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝G250微板法,以牛血清白蛋白(BSA)作标准。
1.5 抗菌实验
1.5.1 菌株 变形链球菌(MT6R)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、大肠杆菌(ML-35P)和绿脓杆菌(ATCC27853)复苏后37℃普通孵箱培养过夜,再转种于含2.2%营养肉汤粉的液体培养基中振摇3 h。比浊管法测定细菌浓度。
1.5.2 琼脂糖弥散抗菌实验 参照Lehrer等［5］建立的方法进行。在培养皿上倾倒一层底层琼脂(10 ml)。底层琼脂含1%琼脂糖,0.022%营养肉汤粉,10 mmol/L PBS(pH7.4),及对数生长期细菌(1.0×106/ml)。在底层琼脂上打直径3 mm的圆孔,每孔加入5 μl HRPs样品,浓度分别为:25、50、100、200、500 μg/ml。200 μg/ml NP1作为阳性对照,0.01%乙酸作为阴性对照。倒置放入孵箱内孵育3 h后,在底层琼脂上覆盖一层2×营养琼脂,过夜孵育,测量抗菌环直径。
2 结 果
唾液蛋白冻干品经AU-PAGE分离后,显示有6条成对的区带泳动在凝胶的最前端(靠阴极端),其迁移距离均超过了溶菌酶;从阳极端起,分别为HRP1～6,其中HRP-1、HRP-3、HRP-5的区带较宽。经纯化后的3条区带的组分再用AU-PAGE和Tricine-SDS-PAGE分析,结果每个组分在两种凝胶上都呈单一区带,表明纯化效果良好。由图2还可看出,3个组分的分子量均在3～5 kD之间。蛋白含量测定结果显示,从100 ml刺激性腮腺唾液中得到HRP-1约70 μg,HRP-3约43 μg,HRP-5约44 μg(图1,2)。
图 1 唾液蛋白及分纯制备的3种主要HRPs的AU－PAGE A 腮腺唾液蛋白，B HRP－1,C HRP－3,D HRP－5,E 鸡蛋白溶菌酶
图 2 唾液蛋白及分纯制备的3种主要HRPs的Tricine－SDS－PAGE A HRP－5,B HRP－3,
C HRP－1，D蛋白质分子量标准，6条带的分子量从上至下分别为43.0,29.0,18.4,14.3,6.2和3.0 kD,E 腮腺唾液蛋白
3种主要HRPs在浓度为25 μg/ml时,对G+的变形链球菌和金黄色葡萄球菌即有明显抗菌环出现,且随浓度增高而增大。3种HRPs中,HRP-3和HRP-5的抗菌活性强于HRP-1。HRP-1在浓度达500 μg/ml时对G-的大肠杆菌和绿脓杆菌仍未显示抗菌活性。而HRP-3及HRP-5在浓度为25 μg/ml时对大肠杆菌即显示抗菌活性;而对绿脓杆菌在浓度达50 μg/ml时才开始有抗菌环出现;抗菌活性均随浓度增高而增大(图3,4)。
图 3 3种主要HRPs对变形链球菌的抗菌活性
A 25μg/m 1,B 50μg/m 1, C 100μ/ml，D 200μ/ml, E 500μg/ml
图 4 3种主要HRPs对大肠杆菌的抗菌活性
A 25μg/m 1,B 50μg/m 1, C 100μ/ml，D 200μ/ml, E 500μg/ml
HRP-1、HRP-3、HRP-5在不同浓度下对不同细菌产生的抗菌环直径不同。可以看出,HRPs的抗菌活性具有剂量依赖性,且不同细菌对HRPs的敏感性不同,表现为变形链球菌大于金黄色葡萄球菌大于大肠杆菌大于绿脓杆菌。NP1(200 μg/ml)作为阳性对照,对5种实验菌株均产生明显抗菌活性,加入0.01%乙酸的阴性对照孔均没有抗菌环出现(图5～7)。
图5 HRP-1的抗菌活性
图6 HRP-3的抗菌活性
图7 HRP-5的抗菌活性
3 讨 论
根据Oppenheim等［6］所作的分析结果,HRPs为一组氨基酸序列相似的同源多肽,其3种主要成分HRP-1、HRP-3、HRP-5的分子量分别为4929 D、4063 D和3037 D,它们分别含38、32、24个氨基酸残基(其中约48%为碱性氨基酸),且都在相同的残基位上含有7个组氨酸(histidine)。该作者用阳离子PAGE分析,显示HRPs呈3对区带,分别为HRP-1和HRP-2、HRP-3和HRP-4、HRP-5和HRP-6,而HRP-1、HRP-3、HRP-5的区带较宽。作者纯化的HRPs经AU-PAGE分析结果与之一致,且不含其它杂蛋白区带;检测HRPs分子量为3～5 kD,与上述作者的报道相符合。以上结果说明,这些在分子组成上相差甚微的多肽组分在本实验恰当的电泳条件下,得到满意的分离。酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离阳离子蛋白,具有分辨率高、操作简便、纯化效果好等特点［7］,对HRPs的分纯制备不失为一种简便实用的方法。但是采用这种提纯方法,HRPs的获得率较低。分析其原因,除了在样品处理过程中的丢失外,可能在洗脱电泳时电场力的作用下,属于线性分子的HRPs大量穿过透析袋的微孔,泳动到缓冲液中。因此,本实验所采用的方法还有待改进。
责任编辑：姚红祥 |