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ATG TTG AAA CTN GAC TCA AGT GAA AAA GAC GAA AAT AAA ATG GTC ACC TCG GCT CCA GCT AAG
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图1 pPC41质粒中插入片段的碱基对序列
减毒鼠伤寒沙门氏菌可以作为抗原载体,携带异源性抗原决定簇的质粒制成疫苗进行口服免疫。现代DNA重组技术已可能构建具有定向缺失特征的菌株,可采用缺失一个基因或基因群使细胞丧失它的部分或全部毒性,这种缺失在遗传学上一般是稳定的。Curtiss等构建鼠伤寒沙门氏菌cya、crp缺失突变株,证实这种突变株通过口服途径能引起高水平的保护性免疫反应并显示高度减毒。鼠伤寒沙门氏菌能侵袭与肠道相关的淋巴组织,并在其中繁殖,从而有效地激发抗体和全身特异性的SIgA应答。利用遗传工程的技术可以将亲缘较远的原核生物或寄生虫等更高级生物的抗原基因引入沙门氏菌。Poirier等［3］将携带化脓性链球菌M5蛋白基因的质粒转化鼠伤寒沙门氏菌aroA突变型菌株获得成功。这种菌株免疫小鼠能引起对M5蛋白的血清和粘膜抗体反应。Sadoff等［4］将原虫的小孢子CS蛋白基因引入无毒的沙门氏菌,免疫小鼠5周后,小鼠体内产生特异性抗疟原虫的细胞应答。Doggett［5］克隆了远缘链球菌(S.sobrinus)SpaA抗原0.48 kb的基因片段至鼠伤寒沙门氏菌,免疫BALB/c鼠后,在小鼠唾液中测出抗SpaA IgA的效价。目前的研究提示,沙门氏菌作为疫苗载体的应用可能对细菌等病源体产生较广泛的保护性免疫。本研究将应用基因工程技术获得变形链球菌表面蛋白的结构基因,克隆至减毒鼠伤寒沙门氏菌,构建基因重组防龋疫苗。
主要致龋细菌-变形链球菌的细胞表面蛋白具有高度的免疫原性,蛋白抗原PAc的结构基因pac克隆至埃希氏大肠杆菌MC1601(含pPC41),表面质粒pPC41由变形链球菌MT8148染色体PstI酶切片段通过T4DNA连接酶与经PstI、小牛肠碱性磷酸处理的pUC118连接构成［6］。获得目的基因是进行基因克隆,制备基因重组防龋疫苗的第一步。为了解所获得的pPC41中pac基因的构成情况,本研究应用M13/pUC测序通用引物5'GTAAAACGACGGCCAGT3',结合纯化后的质粒pPC41为模板,采用四标记单泳道法,通过DNA自动测序仪对pac基因上游区进行序列测定。DNA序列分析技术是一个包括DNA样品制备及碱基分析、信息处理的多阶段过程。本研究所用自动测序仪将凝胶电泳、初始信息收集、碱基阅读等步骤自动化,保证了测序反应可连续、高速地进行。用标记单泳道法将4种不同荧光标记物分别标记4个反应的引物,4个反应分开进行,产物合并在一个泳道中电泳分离。每个反应的产物可由特定的荧光标记加以区分,使DNA的顺序由通过检测阅荧光条带的顺序确定。Okahashi等［6,7］分别完成了变形链球菌表面蛋白pac基因的克隆和测序工作。通过pac基因的序列分析,可以促进对表面蛋白的生物学特征及在龋病病因学中作用的了解。pPC41包括pac基因及其上游区,对pac基因上游区进行测序,有助于全面掌握pac基因的结构。本研究完成了pac基因上游区全部核苷酸顺序测定,为今后进一步进行基因重组、pac基因亚克隆提供了实验依据。
责任编辑：姚红祥 |