【摘要】　目的　明确金黄色葡萄球菌能否侵入体外 培养的人成骨细胞，并比较三个不同菌株在侵入能力上的差异。方法　采用三个不同的金黄色葡萄球菌菌株(6571、8325-4和WA250)，取半对数生长期细 菌用于实验。成骨细胞培养自健康成人拔下颌阻生齿手术中之去骨块。侵入实验的细菌与细 胞比例为30：1，侵入发生时间为2小时，细胞外细菌为庆大霉素杀灭。部分被感染的成骨细 胞溶解后用于细菌培养，计算菌落数；部分送电镜观察。结果　6571 菌株对成骨细胞每孔的平均侵入菌落数为1976±269；8325-4为2856±493；WA250为5638±3 81。电镜观察显示，三株均有侵入成骨细胞现象，以WA250侵入最多，其次分别为8325-4和6 571。结论　金黄色葡萄球菌能侵入成骨细胞内，其侵入能力与菌株 本身特点有关。金黄色葡萄球菌侵入成骨细胞后能逃避庆大霉素的杀菌作用,这可能与临床 上骨髓炎不易为抗生素治愈有关。
　　【关键词】　金黄色葡萄球菌　　成骨细胞　　侵入

　　金黄色葡萄球菌是血源性骨髓炎及骨科植入物感染的主要来源，约 有65%～70%的骨髓炎由金黄色葡萄球菌引起［1，2］。金黄色葡萄球菌的表面相关蛋 白 能强有力地刺激骨吸收，抑制骨胶元合成［3，4］。但是有关金黄色葡萄球菌如何引 起骨感染目前仍所知甚少。最近，有研究表明金黄色葡萄球菌能侵入某些体外培养的宿主细 胞，如成纤维细胞、鼠的肾细胞、内皮细胞等［5］。金黄色葡萄球菌的这种侵入真 核细胞的能力可能与其引起骨髓炎的病理机制有关。本文的目的在于明确金黄色葡萄球菌是 否能侵入体外培养的成骨细胞，并比较三个不同菌株在侵入能力上是否存在着差异。

材料和方法

　　细菌培养：金黄色葡萄球菌6571为本实验室所用之标准菌株，8325-4源自经前 噬菌体处理的NTCC8325，agr(accessory gene regulator)阳性，WA250是8325-4的变异株， agr A基因插入Tn551.三个菌株均保存在Willkins-Chalgren琼脂上，于实验开始前2.5 小时在Wilkins-Chalgren液体培养基内培养，并让其生长进入对数生长期。取半对数生长期 细菌用于实验，并用分光光度计测定细菌浓度。细菌以200×g离心10分钟，去上清液，用培 养液DMEM(GIBCOL公司)混匀。
　　成骨细胞培养：人成骨细胞培养自健康成人阻生齿拔除手术中的去骨块。成骨细胞培养方法 同Beresford等人所采用的方法［6］。将骨块上骨膜及纤维性组织完全剔除，剪成直 径3～5mm的细块，用PBS洗去骨髓组织及积血，然后置入75mm培养瓶内，加入DMEM培养液(GI BCOL公司)。培养液含25mM Hepes，100单位/ml-100微克/ml的青-链霉素，10%胎牛血清和2m M L-谷氨酰胺。细胞在37℃、95%空气-5%CO2环境中培养。成骨细胞形态由相差显微镜确 定，碱性磷酸酶活性由组织化学方法［采用 alpha-naphtyl phosphate(Sigma)］证实。取 原代成骨细胞用于侵入实验。
　　侵入分析：将成骨细胞用0.25%胰蛋白酶(GIBCOL公司)处理后，计数，按每孔5×104 个细胞密度加入24孔培养板中过夜。次日，用上述准备好的细菌以MOI为30的比例加入细菌( 1个细胞比30个细菌)后置于摇摆板上，在37℃环境中孵育2小时。2小时后用DMEM液洗涤成骨 细胞，后每孔加入每毫升含100微克庆大霉素(Sigma)的DMEM 1毫升，并继续在37℃环境中培 养2小时。在此期间所有在细胞外的细菌将为庆大霉素杀灭。2小时后仍用DMEM液洗涤成骨细 胞三次，用0.1%三硝基甲苯X-100溶解成骨细胞，取溶解液在Wilkins-Chalgren琼脂培 养基上培养，次日计算菌落数。所有的实验均三份进行，并分别重复三次。
　　庆大霉素的杀菌能力：为确证庆大霉素能完全杀死细菌，按侵入实验中相同的方法，在每孔 中加入相同的细菌数(1.5×106)及1毫升含100微克庆大霉素的DMEM，在37℃环境中孵 育2小时，后取样在Wilkins-Chalgrenp琼脂培养基上培养。

责任编辑：姚红祥