1.7　重组质粒转化DH5α感受态宿主菌

　　常规制备DH5α感受态宿主菌并用连接反应产物转化，转化产物均匀涂布于X-gal+IPTG板上 ，37℃培养过夜［5］。

1.8　重组克隆的筛选和鉴定

　　按照蓝白筛选法的原理，随机挑取数个白色菌落，接种于5ml LB培养基中（含Amp100mg/L） , 37℃，160r/min震荡培养过夜。取3ml菌液离心沉淀，按碱裂解法提取质粒（同1.5） 。酶切（EcoRⅠ/BamHI）及PCR(质粒稀释500倍后充当模板，其余条件同前)鉴定。

1.9　重组质粒中插入片段的序列测定

　　取经鉴定正确的阳性克隆菌种，划线接种至LB琼脂平板上（含Amp100mg/L）, 37℃培 养过夜；取单菌落接种于5ml LB培养基中（含Amp100mg/L）, 37℃，160r/min震荡培养过夜 。用Wizard Minipreps DNA Purification System(Promega公司）提取质粒，用PE317- A型DNA自动测序仪(PE公司,USA)进行序列测定。

2　结果

2.1　变形链球菌基因组DNA提取

　　S.mutans OMZ175基因组DNA的A值为0.0236/0.0128 (300倍倍比稀释后),经计算,其 浓度及纯度均达到作为模板的标准。

2.2　PCR

　　分别以细菌基因组DNA、重组质粒为模板的PCR产物经电泳,均出现略小于0.5kb的条带,与预 期大小 (约0.45 kb)一致（图1、2）。

图1　PCR扩增产物
1：1kb DNA Ladder; 2:PCR产物

图2　PCR及酶切鉴定结果

1：1kb DNA Ladder　　　　　　　4：puc180
2：puc18/gbp Cc EcoRI+BamHI切　5：puc18/gbpCc
3：1kb DNA Ladder6：以puc18/gbpCc为模板的RCR产物

2.3　酶切

　　电泳结果显示,酶切样品出现两条带,大小范围分别为略小于0.5kb及2.0～3.0kb，接近3 .0kb（图2）,与预期结果一致,初步表明我们获得了预期片段。

2.4　序列测定

　　测序结果与Sato等报道的序列一致,未发现任何突变；命名该重组质粒为puc18/gbpCC。

3　讨论

　　变形链球菌族(Mutans Streptococci)是公认的主要致龋菌，在人类又以变形链 球菌组(S.mutans)为主，其次是远缘链球菌(S.sobrinus)［4］。菌斑是龋病赖以发 生的局部微环境，其形成及巩 固有赖于变链菌的粘附与聚集能力。葡聚糖结合蛋白是变链菌粘附、聚集力的重要物质基础 之一，其介导的变链菌对获得性膜原位葡聚糖的粘附是初始粘附的重要组成部分，而蔗糖依 赖性粘附、聚集则是菌斑成熟、稳定所必不可少的。
　　迄今为止，已在S.mutans中发现了3种Gbps，即GbpA、GbpB、GbpC。GbpA发现得 最早，研究得也最为透彻。GbpB的基因尚未克隆，但因其存在于实验室培养的所有S.muta ns中，且经其免疫的小鼠患龋率明显降低，所以被公认为具有较好的研究及应用前景。最近 发现，由于gbpC可在较低浓度的抗生素中被诱导表达，体现了细菌的适应性，因此引起 了我们的极大兴趣。探讨其基因表达调控的机制，有助于阐明致龋菌与宿主间相互作用的机 理，从而为防龋研究和实践提供新的思路和方法。为此，本研究试图从血清型为f的S.mutan s OMZ175中获得该基因的特异性片段，然后实现原核表达，以便为进一步的研究打下基础。 实验结果表明我们已实现了第一个目标。
　　研究表明，Gbps结合葡聚糖的能力源于其葡聚糖结合结构域（Glucan-binding domain, GBD ），该结构域的功能与GTF的葡聚糖结合区（Glucan-binding region, GBR）的相似，但其 氨基酸组成目前还不太确定，在蛋白中的位置也不固定。尽管Banas等认为所谓的A重复（ A Repeats）与C重复（C repeats）就是GBD，但Sato等却未在GbpC中发现类似结构，所以目 前还有争议。需要积累更多的资料以帮助分析、归纳。
　　我们所测得的部分序列与Sato等报道的gbpC序列一致，表明我们已成功克隆了gbpC基因片 段，为进一步的研究奠定了基础。

责任编辑：姚红祥