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图1 部分纯化的菌毛抗原制备的抗血清，双向免疫扩散法测定效价及交叉免疫反应 A：部分纯化I型菌毛F(I，I)，B：部分纯化Ⅱ型菌抟F(Ⅱ，I)，C：抗F(I，I)抗血清
经免疫吸附后得到的两种抗血清的双向免疫扩散法检测交叉免疫反应结果见图2。图2则显示,经免疫吸附后得到的两种抗血清与两种抗原间无交叉反应。因此,两种吸附过的抗血清分别是抗Ⅰ型菌毛抗血清和抗Ⅱ型菌毛抗血清。
图2 经免疫吸附后得到的两种抗血清，双向免疫扩散法检测交叉免疫反应 A：A：部分纯化I型菌毛F(I，I)，B：部分纯化Ⅱ型菌抟F(Ⅱ，I)，C：吸附粘放菌5951的抗F(I，I)抗血清，D：吸附粘放菌5519的抗F(Ⅱ，I)抗血清
2.2 两种菌毛纯化物的免疫学纯度
两种菌毛纯化物的免疫学纯度鉴定结果见图3、4。图3表明F(Ⅰ,1,1)只有一种抗原成分,即Ⅰ型菌毛;图4则说明F(Ⅱ,1,1)也只有一种抗原成分,即Ⅱ型菌毛。
图3 I型菌毛提取物的免疫电泳 A：部分纯化物F(Ⅱ，I)，B：纯化物F(I，I，I)，C：抗I型菌毛部分纯化物F(I，I)抗血清，D：免疫吸附制备的抗I型菌毛抗血精
图4 Ⅱ型菌毛提取物的免疫电泳 A：部分纯化物F(Ⅱ，I)，B：纯化物F(Ⅱ，I，I)，C：抗Ⅱ型菌毛部分纯化物F(Ⅱ，I)抗血清，D：免疫吸附制备的抗Ⅱ型菌毛抗血精
2.3 菌毛蛋白质含量、糖含量
1 mg冰冻干燥Ⅰ型菌毛样品F(Ⅰ,1,1)含蛋白质0.79 mg,含糖约0.01 mg;1 mg冰冻干燥Ⅱ型菌毛样品F(Ⅱ,1,1)含蛋白质0.72 mg,含糖约0.02 mg。
2.4 菌毛氨基酸组成
两种菌毛蛋白质的氨基酸组成的百分含量结果见表1。
表1 两种菌毛蛋白质的氨基酸组成(%)
| 氨基酸 |
Ⅰ型菌毛 |
Ⅱ型菌毛 |
| 酸性 |
(24.8) |
(20.9) |
| Asp |
10.6 |
10.6 |
| Glu |
14.2 |
10.3 |
| 碱性 |
(14.1) |
(13.5) |
| Lys |
7.1 |
6.0 |
| Arg |
5.2 |
5.4 |
| His |
1.8 |
2.1 |
| 极性不带电荷 |
(18.3) |
(20.9) |
| Gly |
5.8 |
6.8 |
| Thy |
5.4 |
5.7 |
| Ser |
4.6 |
6.2 |
| Tyr |
2.5 |
2.2 |
| Cys |
| 非极性 |
(38.6) |
(38.9) |
| Ala |
8.1 |
8.6 |
| Leu |
8.1 |
8.3 |
| Val |
5.7 |
5.6 |
| ILe |
5.6 |
5.7 |
| Phe |
5.4 |
5.7 |
| Pro |
3.0 |
3.6 |
| Met |
2.7 |
1.4 |
3 讨 论
3.1 抗Ⅰ型菌毛抗体和抗Ⅱ型菌毛抗体的制备
本实验采用Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛的部分纯化组分分别获得两种兔抗血清。由于抗原成分除含有菌毛,还含有细胞壁成分等,结果也表明制备的两种抗血清与两种抗原成分间有交叉反应,所以两种抗血清并不是特异性针对Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛。
国外研究结果表明,粘放菌Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛虽然有33%同源性［6］,但不存在交叉反应,说明两种菌毛间无相同的抗原决定簇［6～9］。本实验采用免疫吸附方法,以去除针对菌毛外抗原的抗体成分,保留抗菌毛的抗体。双向免疫扩散实验结果表明,吸附过的抗血清不发生交叉反应,因此,两种吸附过的抗血清分别是抗Ⅰ型菌毛和抗Ⅱ型菌毛的抗血清。
3.2 两种菌毛纯化物的免疫学纯度鉴定
因为菌毛纯化物是菌毛部分纯化物经再次柱层析纯化得到,所以,当它们同时与抗菌毛部分纯化物抗体反应时,如果菌毛提取物含有多种抗原成分,就会出现多条沉淀弧。本实验结果显示,菌毛部分纯化物出现两条沉淀弧,而菌毛纯化物有一条沉淀弧。当它们同时与特异性抗菌毛抗体反应时,非菌毛抗原成分就不能与抗体反应出现沉淀弧。本实验结果也显示菌毛部分纯化物只出现一条沉淀弧,纯化物仍只有一条沉淀弧。因此可以认为,所提取纯化的Ⅰ型菌毛F(Ⅰ,1,1)和Ⅱ型菌毛F(Ⅱ,1,1)分别只含有一种抗原成分,即Ⅰ型或Ⅱ型菌毛,在此基础上,进一步分析两种菌毛的化学组成和氨基酸组成。
3.3 两种菌毛的化学组成分析
国外研究［2～4］结果表明:粘放菌T14V和WVU627两种菌株的菌毛化学组分大致相似。粘放菌T14V菌毛有95.2%蛋白质和低于2%的碳水化合物;粘放菌WVU627菌毛蛋白质与还原糖之比为27.5,还有少量的甲基戊糖和磷。本实验测定了两种菌毛的蛋白质和糖的含量。结果显示:蛋白质占两种菌毛成分均达70%以上,糖含量相对较低。结合国外研究结果,可以认为蛋白质是构成菌毛的主要物质基础。
责任编辑：姚红祥 |