图3　Southern杂交结果　A：特异引物扩增DNA片段与S.srDIG探针杂交阳性，B：非特异引物扩增DNA片段与S.srDIG探针在800bp杂交阳性

图4　DIG斑点杂交结果　A、B、C：血链球菌临床分离株，D：唾液链球菌模式分离株，E、F、G：变链球菌血清型c、f、d，H：S34sr，I：S34非1，J：产气杆菌，K：葡萄球菌，L：奈瑟氏菌，阴性对照：TE液，阳性对照：ATCC10556特异引物PCR扩增产物

3　讨　　论

3.1　设计特异引物PCR扩增结果评价
　　本文设计的一对引物是根据ATCC10556特异DNA片段已知序列所设计的一对引物,含有大部分nif基因。实验结果再次验证用TA克隆系统进行PCR片段转化克隆成功,结果确切,同时也再次证实血链球菌ATCC10556确含有nif基因同源序列,有效序列长度为765个碱基。本研究的DNA碱基序列仅含有部分nifs和nifu基因序列,并不能完成细菌蛋白表达［2］,血链球菌哪一种蛋白或功能表达与nifs和nifu基因有关是研究关键,设计适宜引物进行DNA片段多次克隆及表达研究,寻找ATCC10556 nif完整基因是目前首要任务。
　　nif基因已在10余株细菌中发现［3,9］,作者对口腔中大部分口腔链球菌菌群进行检测,除ATCC10556及S34sr外,其它菌株未扩增出同样DNA片段,显示了ATCC10556血链球菌DNA基因片段具有较强的特异性。能否完全判断上述微生物中不存在同样的nif基因,证据还不充分。主要原因是作者设计的一对引物长度仅是20和17个碱基,扩增条件要求高,在其它种属细菌中完全扩增同等DNA片段可能性较小,只有与ATCC10556遗传特性非常相近的细菌才有可能,因此尚需运用更好的检测手段进行验证。
3.2　DIG探针评价及临床应用
　　本研究运用的随机引物法地高辛标记是近年来发展起来的一种较为理想的核酸探针标记方法,并有取代缺口平移法而作为实验室中DNA探针标记的常规方法趋势［5］。本研究制备的DIG探针包含ATCC10556全部nif基因序列,比特异引物PCR扩增检测方法特异性更准确,特异性更高,敏感性好,细菌只要含有部分同源碱基序列即可检出。本实验表明,制备的DIG探针与ATCC10556亲缘性非常相近的血链球菌S34sr,S34非1杂交强阳性,表明这两种菌株含有nif基因,另两株血链球菌临床分离株斑点杂交呈弱阳性,表明可能存在与ATCC10556部分基因序列相似的DNA。
　　作者曾探讨血链球菌ATCC10556含有nif基因同源序列,推测其功能与其产生过氧化氢相关［1］。DIG探针的制备使进行此方面相关性研究手段简化,通过DIG探针检测,Southern或斑点杂交寻找血链球菌nif基因表达及相关性的研究将指日可待。
3.3　DNA提取方法的改进利于临床检测
　　血链球菌外膜蛋白富含糖蛋白,在提取DNA时常由于蛋白污染导致DNA纯度下降,因此提取DNA过程中如何去除蛋白质尤为重要。本实验采用煮沸法提取细菌DNA,实验方法简单,蛋白更易变性。本实验自配的细菌裂解液较适用于口腔链球菌,提取的DNA纯度与传统提取方法即酚和氯仿抽提无明显差异,使PCR技术应用于口腔链球菌的检测更为实用化,也为本课题进一步深入研究提供一种较为有效的方法。

本课题由美国中华医学会CMB基金资助

作者单位：潘亚萍　中国医科大学口腔医学院口腔内科学教研室　110002
　　　　　赵彦艳　孙开来　中国医科大学基础医学院遗传学教研室
　　　　　章锦才　华西医科大学口腔医学院

参考文献

　1　潘亚萍,王红杨,金春元,等.血链球菌部分基因克隆及与nif基因同源序列初探.华西口腔医学杂志,1999,17(1):9～11
　2　Ouzounis C, Sander C. Homology of the nifs family of proteins to a new class of pyridosal phosphate-department enzymes. FEBS Lett, 1993, 322(1):159～164
　3　阎大来,何路红,李秀伦.巴西固氮螺菌ntrBc基因克隆与核苷酸序列分析.微生物学报,1995,35(1):242～249
　4　Sun D, Setlow P. Cloning, nucleotide sequence and regulation of the bacillus subtilis and a nifs-like gene, both of which are essential. J Bacteriol, 1993, 175(5):1423～1432

责任编辑：姚红祥