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2 结 果
2.1 Sephadex G75层析结果
1 mol/L NaCl洗脱的SAP组份(SA)经Sephadex G75层析后可得3个组份(SAG1～SAG3)(图1,A);0.5 mol/L LPB洗脱的SAP组份(SB)可得4个组份(SBG1～SBG4)(图1,B)。SBG4为单一电泳组份未作进一步纯化。
 
图1 Sephadex A25层析(2.5 cm×75 cm)
A 1.0 mol/L NaCl洗脱蛋白组份 B 0.1 mol/L LPS洗脱SAP组份
2.2 DEAE-Sephadex A25层析
经DEAE-Sphadex A25层析后SAG1可得2个组份(SAG1D1、SAG1D2);SAG2、SAG3主要为一组份;SBG1、SBG2、SBG3为3个组份(SBG1D1-SBG1D3、SBG2D1-SBG2D3、SBG3D1-SBG3D3)。起始缓冲液:0.025 mol/L NaCl和0.05 mol/L Tris-HCl pH8.0,梯度洗脱:0.025～1.200 mol/L NaCl和0.05 mol/L Tris-HCl pH8.0,流速为25 ml/h,每管收集5 ml(图2)。
图2 DEAE-Sephadex A25层析洗脱曲线
A SAG1, B SAG2, C SAG3, D SBG1, E SBG2, F SBG3
2.3 细菌粘附实验结果
细菌粘附实验结果显示淀粉酶组份SAG2、SAG3促粘附作用最强,其它淀粉酶组份、IgA降解片段SBG1D1、SBG2D1和MW为13 kD的蛋白SBG3D2也可促进细菌粘附(图3)。
图3 变链WD9463A对纯化SAP组份的粘附实验结果
细菌粘附竞争抑制实验显示,淀粉酶组份可不同程度地竞争抑制细菌粘附,其中SAG3、SBG4作用最强,可完全抑制细菌粘附,而IgA降解片段和分子量为13 kD的蛋白则无此作用(图4)。
2.4 各促变链粘附SAP组份理化和生化性能鉴定
图4 变链WD9463粘附抑制实验结果
各促变链粘附SAP组份的理化和生物化学性质总结见表1,此8种组份在PAGE中均为单一条带(图5)。
表1 促变链粘附各组份理化和生物化学特性
| 名称 |
分子量
(kD) |
pI |
PAS染色 |
与sIgA
抗体结合 |
淀粉酶
活性 |
| SAG1D1 |
65.60 |
6.88 |
- |
- |
1.57 |
| SAG2 |
60.60 |
6.88 |
+ |
- |
2.41 |
| SAG3 |
57.00 |
6.88 |
+ |
- |
2.34 |
| SBG1D1 |
23.15 |
Nt |
- |
+ |
- |
| SBG2D1 |
23.15 |
Nt |
- |
+ |
- |
| SBG3D1 |
57.00 |
6.88 |
+ |
- |
0.84 |
| SBG3D2 |
13.00 |
4.73～4.85 |
- |
- |
- |
| SBG4 |
63.00 |
6.88 |
+ |
- |
7.49 |
图5 SAP纯化组份PAGE图谱
1.SBG3D1 2.SGB4 3.SAG1D1 4.SAG2 5.SAG3
6.SGB3D2 7.SGB3D3 8.SGB1D1 9.SGB1D2 10.SGB1D3
11.SGB2D1 12.SGB2D2 13.SGB2D3 14.SAG1D2
2.5 氨基酸组份分析
结果表明,SAG1D1、SBG4含有较多的天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸和甘氨酸;SBG2D3酸性氨基酸天门冬氨酸和谷氨酸含量较高;SBG3D2中天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸和谷氨酸含量较高。
综上结果,可认为SAG1D1为非糖酰化淀粉酶,SAG2、SAG3、SBG3D1、SBG4为糖酰化淀粉酶,SBG1D1,SBG2D1为IgA降解片段,SBG3D2是一种小分子量酸性蛋白。
3 讨 论
由于口内唾液获得性膜取材困难、量少,而收集足量SAP标本是分离纯化变链牙面受体的必要条件,本实验用HA作为吸附介质,以全唾液包被HA形成实验组性SAP,这就为研究牙面唾液受体的种类、组成和生理功能提供了充足的材料。不同种类蛋白对HA的吸附机理不同,酸性蛋白主要通过钙桥吸附其上,中性蛋白、碱性蛋白则主要通过静电作用吸附其上［7］。实验采用1 mol/L NaCl洗脱于HA上的中性及碱性蛋白,再用0.5 mol/L PBS洗脱潴留的酸性蛋白。而后Sephadex G75分子筛层析和DEAE-Sephadex A25离子交换层析进一步纯化。结果表明各促变链粘附组份均达PAGE纯,说明分离方法较好。
变链牙面粘附唾液受体是近期防龋研究的热点之一。多数研究都是采用纯化腺体唾液蛋白组份包被HA,通过细菌粘附实验寻找变链的牙面粘附唾液受体。但唾液蛋白对牙面的吸附有高度的选择性,仅有少数唾液蛋白组份可与牙面特异性的结合,而参与获得性膜的形成,因此直接从SAP中分离纯化出与变链粘附有关的唾液蛋白受体是研究变链牙面粘附机理有效而可靠的方法。本实验通过对纯化SAP组份的粘附实验结果表明几种淀粉酶成分和两种IgA降解片段可明显促进变链地方株WD9463A对HA的粘附。这一结果与刘天佳［6］用纯化颌下腺唾液蛋白组份进行粘附实验所得结果相似。实验还发现一种分子量为13 kD的酸性小分子蛋白SBG3D2,其氨基酸组成、等电点及分子量均与Juriaane AC报道的3种对HA有高度亲和力的下颌唾液酸性蛋白相似,它也可促进变链粘附。此3种组份均为实验性全唾液获得性膜的重要组成部分,提示它们是变链在牙面粘附的唾液受体。
责任编辑：姚红祥 |