|
1.6 连接、转化实验
1.6.1 酶切RSV-BL片段的再连接［4］ 取9 μl酶切反应液，加10 μl T4 DNA连接缓冲液，充分混匀后加1 μl T4 DNA连接酶，16℃反应12 h。
1.6.2 感受态细胞的制备［5,6］ 取甘油保种的大肠杆菌XL-1 blue接种于2 ml SOC培养基中，37℃，过夜培养，取0.5 ml过夜培养菌液转种于50 ml SOB培养基，18℃剧烈振荡培养至A600＝0.6。将菌液冰浴10 min后转入50 ml离心管，离心（3500 g×5 min，4℃），用16 ml冰TB缓冲液悬浮沉淀细胞，再次冰浴10 min，离心（5000 g×5 min),沉淀用4 ml含7%二甲基亚枫(dimethylsulfoxide,DMSO）的TB缓冲液悬浮，冰浴10 min，分装至EP管中（每管0.5～1 ml），迅速放入液氮中速冻，保存。
1.6.3 转化［5,6］ 从液氮中取1管大肠杆菌XL-1 blue感受态细胞于室温下解冻分装至新的EP管中（200 μl／管），取2 μl连接反应液与之混匀，冰浴30 min，42℃热冲击30 s后迅速放置于冰上，加 0.8 ml SOC充分混匀，37℃剧烈振摇培养1 h后，取出液体涂布含100 μg／ml氨苄青霉素的SOB琼脂平板。30℃过夜培养。随机挑取数个菌落按前述方法抽提质粒并电泳。
2 结 果
2.1 质粒RSV-BL的浓度和纯度
12次抽提纯化获得的质粒RSV-BL A260值、 A260/A280比值及浓度见图1和表1。
图1 质粒RSV-BL浓度测定曲线
2.2 RSV-BL酶切检测
RSV-BL为双链环状闭合分子，大小为4.4 kb。分子中存在两个EcoRI酶切位点，酶切后可获得 1.4 kb和 3.0 kb两个大小的片段（图 2）。
图2 质粒RSV-BL酶切分析
M：λDNA3/HinD酶切Ⅲ，1：质粒RSV-BL，2～11：代表1～10次抽提样品经EcoRⅠ酶切
2.3 连接、转化检测
经EcoRI酶切的RSV-BL在T4 DNA连接酶作用下重新连接呈闭合环形双链DNA和少量线性双链DNA，转化大肠杆菌XL-1 blue后，从克隆中抽提到质粒RSV（图3）。
图3 质粒RSV-BL电泳图
M：λDNA3/HinD酶切Ⅲ，1～11：代表1～11次抽提样品
表1 12次抽提质粒RSV-BL的浓度与纯度测定
| 序号 |
A260均值 |
A260/A280比值 |
浓度(g/L) |
| 1 |
0.1741 |
2.6 |
0.1149 |
| 2 |
0.1709 |
2.6 |
0.1128 |
| 3 |
0.1644 |
2.0 |
0.1085 |
| 4 |
0.1762 |
2.5 |
0.1163 |
| 5 |
0.1598 |
2.6 |
0.1055 |
| 6 |
0.1683 |
2.4 |
0.1111 |
| 7 |
0.1711 |
2.3 |
0.1129 |
| 8 |
0.1736 |
2.5 |
0.1146 |
| 9 |
0.1652 |
2.1 |
0.1090 |
| 10 |
0.1689 |
2.1 |
0.1115 |
| 11 |
0.1586 |
2.2 |
0.1047 |
| 12 |
0.1601 |
2.3 |
0.1057 |
P>0.05
3 讨 论
分离纯化质粒的方法主要有聚乙二醇沉淀法［3］、柱层析法［2,3］、透析袋电洗脱法［1］、低溶点胶回收法［7］、氯化铯-溴乙锭超速离心法［1,3］。聚乙二醇沉淀法较费时，透析袋洗脱法、低溶点胶回收法受电泳限制，不便大量纯化DNA。这3种方法在纯化过程中均使用酚、氯仿等有机溶剂，在操作时，如果经验欠缺或吸上清时不细心，容易混杂残余的酚等溶剂在样品中，从而影响下一步的克隆等工作。氯化铯-溴乙锭超速离心法需要超速冷冻离心机，纯化的样品需要去除溴化乙锭，虽然可获得较纯的核酸溶液，但成本较高。柱层析洗脱法是近十年来迅速发展起来的有效替代氯化铯-溴乙锭超速离心法的方法，根据层析柱中充填的材料不同，又分为Sepharose 4B柱层析法、生物凝胶A-150柱层析法、玻璃纤维柱层析法。虽然层析柱的制备使质粒纯化的成本较高，但该法避免了使用酚等溶剂，不需要从样品中去除溴化乙锭，短时间内可获得高纯度的核酸溶液。
玻璃纤维柱层析法分离纯化质粒DNA的原理是：用碱裂解法将质粒从细菌细胞中分离出来后(同时用RNaseA破坏细菌RNA），用带有离液序列高的阴离子（chaotrophic anions）的盐类（如盐酸胍)调整己裂解的反应液为高盐结合状态（high salt binding condition），通过离心去除染色体DNA和细胞残余。由于存在离液序列高的阴离子，上清中的质粒DNA在通过玻璃纤维层析柱时能特异性地结合到羊毛绒状的玻璃纤维上，而且，这种结合在水分子有序结构的分解和核酸分子间的相互作用下几秒钟内就可以完成。未能结合的蛋白质、盐等成分通过离心被去除掉。最后用低盐缓冲液或水将结合在玻璃纤维上的DNA洗脱下来［2,8］。
责任编辑：姚红祥 |