由于PAc 蛋白是由其特定的开放阅读框决定编码的，因此在pac基因克隆化工作中选用限制性酶切割制备目的片段时，一定要注意避免产生移框效应而导致编码另外两种阅读框对应的非目的蛋白产物。理想的情况是，限制性酶切割位点下游出现的第一个起始密码是在编码PAc 蛋白的开放阅读框内，但pac基因中所有具单一酶切识别位点的限制性酶在切开pac基因后均产生移框效应，这给pac基因克隆化工作增加了一定的困难，如果仅仅简单地选择两个限制性酶切割制取一段目的基因片段克隆入表达载体，那么所得到的表达产物就不会是PAc 蛋白。因此，在进行pac基因克隆方案设计时，应考虑采取相应的对策以保证开放阅读框的正确性。
　　当选用适当的限制性酶制得pac基因中某个目的片段以后，下一步即将目的片段与载体DNA进行体外重组。由于pac基因内没有能保持PAc 蛋白的开放阅读框不变的单一切点限制性酶，因此可以采取以下克隆化方案构建重组体。
　　融合蛋白方案：某些质粒载体在其准备用于转录外源DNA的启动子下游 附近具有起始密码，因此，在插入外源DNA片段后可表达融合蛋白，此种蛋白的一部分由载体DNA编码，另一部分由外源DNA编码，融合蛋白可具有外源基因编码的天然蛋白的功能及抗原性。只要选择适当的克隆载体及限制性酶，校对阅读框至准确无误，就可以将切割好的pac基因片段构建到读框正确的融合基因中，从而解决因pac基因中缺少不改变PAc 蛋白阅读框的单一切点限制性酶带来的难题。
　　PCR方案：聚合酶链反应（PCR）扩增目的基因方案最大的优点是可完全不受pac基因内单一切点限制性酶的局限，根据研究目的不同可任意选择pac基因中一段DNA序列作为模板序列，在设计引物时将准备用作载体的质粒多克隆位点上选定的限制性酶识别序列作为引物的一部分，如此扩增片段的两个末端即带上了与质粒相同的限制性酶切点，载体和扩增片段都用同样的酶消化后即可将后者克隆入载体，完成重组体的构建。通过PCR得到的DNA产物特异性强，使用此方案可使pac基因的克隆化操作变得更为准确和快捷。

本课题受国家自然科学基金资助(基金编号39770799)
［作者简介］　彭志翔（1963～），男，湖北武汉人，湖北医科大学口腔医学院口腔内科主治医师，博士研究生。
边专（湖北医科大学口腔医学院，　湖北　武汉　430079）
彭志翔（湖北医科大学口腔医学院，　湖北　武汉　430079）
樊明文（湖北医科大学口腔医学院，　湖北　武汉　430079）

参考文献

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责任编辑：姚红祥