讨　论

　　一、关于转基因植物生产疫苗
　　利用转基因植物作为生物反应器，将外源基因引入植物内，以生产药用多肽和医用疫苗，这是继转基因动物之后近年来新兴的研究领域。用植物生产疫苗有其它生产系统不可比拟的优点：①　易于形成产业化规模，在筛选到高表达植株后，只需增加耕种面积就能大规模生产；②　价格便宜。因为植物易于栽培和管理，较目前动物或酵母菌生产疫苗的方法更有利于降低成本，对发展中国家来说有广泛的应用前景；③　安全。植物病毒不会感染人类，使污染了疫苗制品，也不会象动物病毒伤害人类；④　使用方便。转基因植物疫苗采取口服的方式接种，不需纯化和注射，更易被人们所接受。
　　植物遗传转化技术的发展带动了对植物基因表达外源抗原的研究。自从1990年第一例利用植物表达系统生产口服疫苗的报告在国际专利合作公约出现后，越来越多的学者注重于转基因植物生产疫苗的研究。1995年和1998年Arntzen研究小组分别报道了鼠及人群在口服转基因植物后，可在体内产生主动免疫反应来防治大肠杆菌和霍乱弧菌引起的腹泻［2，3］。因为目前多使用的植物如马铃薯等必须经过热加工后方可食用，烹调过程中会破坏其中的疫苗有效成分，番茄营养丰富且可无须热加工直接食用或制成番茄酱，因此本课题选择番茄做为生物反应器，研制携带变形链球菌表面蛋白SBR基因的转基因番茄的防龋疫苗。
　　二、唾液粘附区植物表达载体的构建
　　变形链球菌是龋病的主要致病因子，其表面蛋白抗原是毒力因子，大约180－210Kda。来自变形链球菌的抗原AgⅠ/Ⅱ在细菌和吸附在牙面的唾液糖蛋白（salivary glycoproteins, SGPs）之间起作用［4，5］，可能作为一种粘附因子［6，7］。对AgⅠ/Ⅱ全分子的S－IgA抗体能抑制变形链球菌的粘附、克隆和龋病的发展［7，8］。说明表面蛋白抗原具有粘附区，从而能够引起细菌的聚集、细菌与牙面的粘附以及细菌在牙面的克隆。目前的研究发现这个粘附因子含两个粘附区：N端富丙氨酸区及中间富脯氨酸区，这两个区域在种属间具有高度的保守性。Brady等［9］报道P1蛋白的富丙氨酸区参与液态唾液凝集素介导的链球菌凝集，与凝集素覆盖的羟磷灰石结合的位点可能位于中间和C末端区。然而Crowly等［10，11］研究发现P1蛋白的富丙氨酸区是直接与唾液凝集素作用的重要区，以及这种作用干扰细菌的粘附和凝集机制。Hajshengallis 等［12］研究发现SBR与霍乱弧菌B亚单位的嵌合蛋白能引起长时间的抗AgⅠ/Ⅱ的唾液IgA和血清IgG反应，甚至在佐剂缺乏时。Moisset A等［13］报道与唾液糖蛋白作用的区域位于N末端，用AgⅠ/Ⅱ的唾液素粘附区多肽免疫的机理是刺激抗体提高特异性凝集作用，有助于唾液凝集素介导的口腔链球菌的非免疫性清除。
　　Taq DNA聚合酶具有一种非模板依赖性的活性，能在双链DNA分子的3′末端添加一个A。本实验采用的pGEM-T easy 载体是利用Taq DNA聚合酶的这种特性设计的一种3′末端突出单个T的线性质粒，是一种中间载体。根据T－A互补的原理，PCR产物可以直接连接到载体上,从而进一步利用共同的酶切位点将目的基因转移到植物表达质粒。pROKCP是转基因植物技术中较好的中间质粒，它是由pROKⅡ插入一个带植物病毒CaMV的35S启动子、终止子和多酶切位点的片段构建而成。35S启动子能使外源基因在植物细胞中表达，并且表达量异常高。P1片段保留唾液粘附区的前端信号肽，以便能通过信号肽的引导穿过细胞壁转入到胞外。pROP1是pROKCP质粒与P1片段结合的产物，其中含有卡那霉素的抗性基因，有助于组织培养过程中所需植株的筛选。虽然pROP1的抗性基因已经能够作为筛选的标志，但是，如果pROP1加上抗除草剂基因（Bar）构成pPRB1质粒更加增强筛选的强度，Bar基因有利于植株移植土壤后起抗除草剂的作用。至此，本课题已成功的构建了变形链球菌表面蛋白唾液粘附区的植物表达质粒，为下一步构建农杆菌载体打下基础。

责任编辑：姚红祥