摘　要：目的　研究已证实，全反式维甲酸(All trans retinoic acid,ATRA)联合γ-干扰素(Interferon-γ，γ-IFN)对舌鳞癌细胞系(Tca 8113)细胞有协同抗增殖和诱导调亡作用?维甲酸受体-β(Retinoic acid receptors-β,RARβ)是介导维甲酸对鳞癌细胞起作用的关键基因。为了明确ATRA联合IFNγ对Tca 8113细胞协同抗增殖作用机理，我们对RAR β-mRNA表达进行了研究。方法　在该研究中采用了RT-PCR半定量检测方法检测RAR β表达水平；活细胞计数法用来进行观察细胞生长抑制情况。结果　1μmol/L全反式维甲酸和1000μ/ml IFN γ单独应用时对Tca 8113细胞生长抑制率分别为39.2%和44.4%。该两种药物联合应用时产生明显协同抗增殖作用(86.7%)，并且发现IFN γ与低于有效药物浓度的ATRA (0.1μmol/L)共同作用时亦能产生协同抗增殖效果。ATRA (1μmol/L)、FIN γ(1000μ/ml)分别处理Tca 8113细胞后其RAR β转录水平分别提高4倍和3倍，以上浓度的ATRA和IFN γ共同处理后，细胞RAR β转录水平增高12倍。结论　研究结果表明，IFN γ与ATRA联合应用能显著提高其对Tca 8113细胞的抗增殖作用，而且证明IFN γ协同ATRA上调RAR β基因转录表达是其对Tca 8113细胞产生协同抗增殖作用的关键机理所在。

　　临床应用已证明，维甲酸能有效地治疗口腔白斑等癌前病变，并能预防或延迟头颈部第二原发癌的发生^［1，2］。尽管维甲酸治疗癌前病变临床效果得到了肯定，但它对头颈部原发癌和其它实体瘤的抗瘤作用效果却不理想^［1，3］。而干扰素联合维甲酸治疗宫颈鳞癌、皮肤鳞癌及乳腺癌取得了一定的效果^［4，5］。我们实验室以前进行的一项研究也证实，γ-干扰素联合全反式维甲酸对体外培养的鳞癌细胞系(Tca 8113)细胞有协同抗增殖和诱导调亡作用^［6，7］，但作用的机理到目前为止仍不清楚。对乳腺癌细胞研究表明，干扰素是通过诱导或提高核维甲酸受体(RARs和RXRs)表达达到调节维甲酸的作用^［8］，进而提高维甲酸耐受细胞的敏感性。对鳞状细胞癌研究表明，RAR β基因的低表达可能导致鳞癌的发生、发展；维甲酸处理能够上调其表达水平^［9，10］，因此，当我们研究维甲酸和干扰素对头颈部鳞癌协同抗增殖和诱导调亡作用机理时，把注意力集中在RAR β基因转录表达方面。

　　1　材料和方法

　　1.1　试剂：

　　全反式维甲酸购自Sigema公司。无水乙醇配制成10^-2mol/L浓度。人类重组干扰素-γ(购自GiBco BRL公司)，用PBS配制成1×10⁵μ/ml溶液。以上试剂避光贮存于-40℃，用时加培养液稀释到终浓度。

　　1.2　细胞培养和药物处理：

　　实验选用的人舌鳞癌细胞系(Tca 8113)是我们实验室于1981年建立的，体外培养平均倍增时间为38.8h±4h，细胞单层贴壁生长在含15%牛血清的RPMI 1640培养液中，培养条件为37℃饱和湿度，5%CO₂和95%的空气。

　　细胞生长抑制试验：细胞培养在含或不含ATRA、IFN γ培养液中，对照组加入同等量的乙醇。培养液在第3、5、7、9天更换，于第10天收集细胞，血细胞计数器计数。细胞生长抑制率按下面公式计算：

　　1.3　总RNA的抽提：

　　收集细胞溶解在1ml TRI zol试剂(购自Gibco试剂公司)中。细胞总RNA按TRIzol试剂说明书进行抽提。样品RNA溶解在20μlDEPL水中。应用DU-640分光光度计测定样品RNA纯度并定量。

　　1.4　逆转录反应合成cDNA模板：

　　取2.0μg RNA在70℃下灭活10min，迅速放置冰中。在20μl体系中合成cDNA第一链：体系组成为：4单位RNasin,10×buffer 2μl,25mmol/L MgCl₂ 4μl,oligo (dT) 0.5 μg、RNA 2μg、dNTP 0.5mmol/L,AMV逆转录酶15u。离心混均后，24℃反应10min，42℃ 15min，95℃ 5min灭活。以上试剂均购自Promega公司。

　　1.5　PCR共同扩增：

　　应用10μl cDNA产物同时进行扩增特异引物RAR β和β-actin。设计两只阴性对照组：空白对照(无cDNA)和RT阴性对照(无RNA样品)，在50μl PCR反应体系中分别加入10μmol/L Tris HCl,50mmol/L KCl,2mmol/L MgCl

责任编辑：姚红祥