摘　要：目的:探讨DMBA诱导金黄地鼠颊囊癌变过程中端粒长度动态变化。方法:应用Southern杂交技术分析金黄地鼠颊囊癌变组织端粒DNA序列长度。结果:金黄地鼠颊囊癌变过程中,癌变侧颊囊粘膜组织端粒长度较自身正常对照侧明显缩短,尤以诱癌后期缩短速率最快。结论:端粒长度缩短在癌变早期显著。

　　随着现代分子生物学、遗传学对癌变机理的研究发展,人们认识到癌变过程是正常细胞转变成无限增殖、逃避凋亡的癌细胞的过程。国外研究显示^［1］,细胞的寿命是受染色体末端结构——端粒(telomere)DNA序列长度控制。端粒长度的缩短可影响染色体稳定性,染色体可能发生融合、重组和被末端降解酶类作用,从而导致染色体分解,细胞进入凋亡。有研究表明^［2，3］正常细胞与癌细胞的端粒长度有差别,人们在一些瘤株和永生化细胞系以及癌肿组织中发现其端粒长度比正常组织细胞明显缩短。目前国内外对口腔癌变过程中端粒的行为的研究较少,对动态观察的报道则更少见。本实验研究,通过应用化学诱癌剂诱发金黄地鼠颊囊产生癌变,建立实验性口腔癌变模型,采用现代分子生物学技术观察测定端粒长度在诱发癌变动态过程中的变化,以期了解端粒在癌变过程中的作用,初步探讨口腔癌变的分子机理。

　　1　材料和方法

　　1.1　主要试剂与设备

　　二甲基苯并蒽(DMBA,Sigma公司),Denhardt液(自配),5′-(CCTAA)₄-3′寡核苷酸探针(北京赛百盛公司),5′-末端DNA标记药盒(Boehringer Manmheim公司),Model 785 Vacuum Blotter(BIO-RAD公司),多功能反应杂交仪(协海医疗仪器公司),Gel Doc-1000型凝胶成像系统(BIO-RAD公司)。

　　1.2　动物模型建立及分组

　　金黄地鼠颊囊癌变动物模型的建立参见参考文献［5］。选用8周龄叙利亚金黄地鼠52只,随机分为5组,第1组4只,不加任何处理措施,饲养3 d处死。其余4组为涂药组,各12只,用0.5%DMBA丙酮溶液涂布于地鼠右侧颊囊粘膜,颊囊左侧涂丙酮液作自身对照。每周涂药2次,至第12周。分别在涂药后第7、10、14、20周末肉眼观察和记录,然后断颈处死地鼠,取颊囊组织块分别做HE染色组织切片进行光镜观察,并做端粒长度检测。

　　1.3　Southern杂交测定染色体末端DNA重复片段长度

　　1.3.1　原理　利用限制性内切酶作用组织DNA,得到染色体末端DNA重复片段5′-TTAGGG-3′线性结构(terminal restriction fragment,TRF),以碱基配对原理,用同位素标记的5′-(CCCTAA)₄-3′寡核苷酸探针与之杂交,测定杂交带峰值处DNA长度,即为TRF长度均值,以此表示端粒长度。

　　1.3.2　Southern杂交　酚-氯仿抽提法制备地鼠颊囊粘膜组织DNA,用HinfⅠ单酶消化DNA,消化的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳,分子量标准采用Hind Ⅲ酶切加入DNA和48 高分子量DNA标准,紫外光投射仪上准确记录DNA分子量标准的各带所距加样孔距离,作为杂交后测算杂交带峰值DNA长度参照距离。电泳后凝胶置于Model 785真空转膜装置上,把DNA转移至尼龙膜上,用同位素γ-³²P标记的5′-(CCCTAA)₄-3′寡核苷酸探针与膜杂交,杂交膜置X线片暗盒内,-20℃放射自显影48 h。

　　1.3.3　X线片扫描分析 常规X线片显影、定影。采用Gel Doc-1000型凝胶成像系统扫描分析X线片,确定杂交带峰值位置,并测定峰值距膜顶边距离,对照分子量标准求得TRF长度均值。

　　1.4　数据统计学处理

　　所测定的端粒长度数据,采用t检验分析各组差异,采用线性回归进行相关分析,检验水准为α=0.05。

　　2　结 果

　　2.1　金黄地鼠颊囊癌变组织学观察

　　经大体和光镜下观察,地鼠颊囊涂DMBA侧粘膜癌变过程中各组地鼠颊囊粘膜的病理改变结果见表1,自身对照组各期颊囊粘膜无变化,光镜下检查与正常颊囊粘膜表现一致。

表1 各组金黄地鼠涂DMBA侧颊囊粘膜

　　病理改变结果(单位:只)

责任编辑：姚红祥