摘　要：目的:分析能合成端粒DNA重复序列的端粒酶在DMBA诱导金黄地鼠颊囊癌变动态过程中的动态变化。方法:采用PCR基础上的端粒DNA重复序列扩增法和ELISA酶免疫技术,测定颊囊癌变组织端粒酶动态变化。结果:在诱癌过程中,颊囊粘膜组织端粒酶活性随组织病理学改变向恶性转化而增高,与自身对照相比较有显著差异,其升高在诱癌后期最明显。结论:端粒酶激活是肿瘤形成的早期分子标志,也是端粒长度稳定的主要因素。

　　近年来的研究发现,细胞的增殖与凋亡受染色体末端结构端粒长度控制,当端粒长度缩短到一定时,染色体稳定性降低,可能出现融合、重组甚至分解,导致细胞停止分裂增殖而进入凋亡。而端粒酶是一种能添加端粒DNA重复序列至染色体末端的核糖核酸蛋白酶,它具有类似逆转录酶功能,可以自身RNA为模板合成端粒DNA重复序列,并转接到染色体3′末端,维持端粒长度^［1,2］。研究表明,大多数正常组织和体细胞内端粒酶活性难测到(阳性率仅4%左右)。但端粒酶与恶性肿瘤发生有密切相关性。Kim等^［3］和Counter等^［4］研究报道，112种恶性肿瘤细胞株和肿瘤组织端粒酶活性阳性率高达85％以上。在正常细胞恶性转化中，细胞端粒长度明显缩短，而端粒酶激活使染色体端粒稳定地维持在一定长度，导致恶性转化细胞无限增殖，成为永生不死细胞（immortal cell）。目前对于端粒酶激活以及调控机理还认识不清。1994年Kim等^［3］首次报道了结合PCR技术测端粒酶活性的端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplification protocol，TRAP）,这使测定各种组织端粒酶活性成为可能。本研究首次应用PCR-TRAP法结合ELISA分析法，半定量测定金黄地鼠颊囊癌变过程中的端粒酶动态改变，结合端粒长度变化，分析和了解端粒酶在癌变过程中的作用，并为进一步研究针对端粒酶的肿瘤基因治疗提供一定的实验依据。

　　1　材料和方法

　　1.1　主要试剂与设备

　　二甲基苯并蒽(DMBA,Sigma公司,美国),5′-（CCCTAA)₄-3′寡核苷酸探针(北京赛百盛公司),考马斯亮蓝染料(Sigma公司),端粒酶PCR-ELISA检测药盒（Boehringer Mannheinn公司),GeneAmp PCR 9600 Thermal Cycler(BIO-RAD公司),SHZ-22水浴恒温振荡器(江苏省太仓医疗器械厂),EL312 microplate Bio-Kinetics reader(美国)。

　　1.2　金黄地鼠颊囊癌变动物模型建立

　　用DMBA诱导，参见参考文献［5］。

　　1.3　金黄地鼠颊囊粘膜组织端粒长度测定

　　Southern杂交法参见参考文献［5］。

　　1.4　金黄地鼠颊囊粘膜组织端粒酶活性检测

　　1.4.1　原理 考马斯亮蓝染色确定检测样本含端粒酶蛋白量，利用端粒酶具有逆转录功能，作用其底物（telomerase substrate，TS），合成端粒重复序列TTAGGG，以此作为数目不等的模板，再经PCR循环扩增，放大端粒酶功能活性，用高灵敏度、非放射性的ELISA方法检测PCR产物量，设定阳性和阴性对照,以OD值作比较，判定端粒酶活性。

　　1.4.2　操作步骤 按端粒酶PCR-ELISA检测药盒说明进行，检测样本端粒酶蛋白量确定为1 μg/μl，在EL312e Microplate读数仪上测定OD值，以此判定端粒酶活性。

　　1.5　数据统计学处理

　　所测定的数据,采用t检验和方差分析进行各组差异分析,采用线性回归进行相关分析，检验水准α=0.05。

　　2　结 果

　　2.1　金黄地鼠颊囊癌变过程中端粒酶动态变化观察

　　金黄地鼠颊囊癌变过程中不同时期的端粒酶活性OD值结果见表1。每次检测以药盒提供的阳性对照（胚胎肾细胞株HEK293细胞）和煮沸法产生的阴性对照做ELISA检测显色反应，其OD值分别为：0.580±0.015和0.046±0.00352以此作端粒酶活性阴阳性标准，当样本OD值除以阴性对照OD值大于等于2时判定为阳性例，并以样本OD值除以阳性对照OD值计算相对端粒酶活性值，其结果见表2。

表1 地鼠颊囊癌变过程中不同时期的

责任编辑：姚红祥