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摘要 目的:探讨CDK4蛋白在口腔粘膜癌变过程中表达的变化规律。方法:采用链菌素-生物素免疫组织化学染色法,对正常口腔粘膜、癌前损害、口腔鳞状细胞癌等共计80例标本中CDK4蛋白的表达进行检测,并与同批标本的P16蛋白的免疫组织化学染色结果进行相关性分析。结果:口腔粘膜癌前损害中出现CDK4蛋白的过表达,其阳性率及表达强度与P16蛋白的表达密切相关。结论:CDK4的过表达可能是口腔粘膜癌前损害发生发展中的增殖刺激因子,并可能引发P16的代偿作用。
细胞周期调控因素的研究已成为研究热点,作者曾报道肿瘤抑制基因CDKN2的蛋白产物、细胞周期负性调节因子P16蛋白在口腔粘膜癌前损害演进过程中变化规律［1］。在此,作者在其同批标本中用免疫组织化学染色法研究P16蛋白作用底物细胞周期依赖激酶4(cyclin dependant kinase 4,CDK4)的改变情况,以期为明确细胞周期调控因子在口腔粘膜癌变过程中的作用积累资料。
1 材料和方法
1.1 标本选择
纳入标准:参照WHO1983年有关口腔粘膜癌前损害的分类标准,分别选择正常口腔粘膜,上皮单纯增生,轻、中、重度异常增生,无转移浸润性鳞状细胞癌,伴转移的浸润性鳞状细胞癌及其淋巴结转移灶各10例,共计80例研究标本。
排除标准:标本过厚,难以保证取材后能达到迅速完全固定;或标本中病灶过小,作连续切片后难以保证每张切片上均有典型病变;标本相应的临床和病理资料不全;患者接受过放疗、化疗、热疗等均不纳入。
1.2 主要试剂
兔抗人CDK4多克隆抗体(sc-748)(Santa Cruz公司,美国)。LSAB药盒、DAB(DAKO公司,美国)。
1.3 实验方法
免疫组织化学染色采用微波脱交联的LSAB法。选用经Northern杂交证实为CDK4阳性的纤维肉瘤为阳性对照,腺样淋巴增生组织为阴性对照,分别用PBS和非免疫一抗同源血清(兔血清)为空白对照和替代对照。结果采用1996年全国免疫组织化学技术与诊断标准化专题研讨会所推荐的阳性细胞强度指数法(staining intensity index,SII)进行半定量结果判定,选择5个典型高倍视野(×400),每视野内随机计数100个上皮细胞,共计500个,与阳性、阴性对照切片中的典型细胞比较,按其阳性着色程度,由阴性至强阳性分为0～3共4级,A、B、C、D为相应级别的细胞百分数。SII=(A×0+B×2+C×3+D×4)/100。
2 结 果
2.1 CDK4免疫组织化学染色结果
CDK4染色阳性反应产物出现于胞浆和(或)胞核,且抗原的表达强度也随着由正常粘膜至异常增生的发展而逐渐增强。正常口腔粘膜、上皮单纯增生组中,阳性反应主要定位于细胞核内;而在上皮异常增生各组及浸润癌中阳性反应逐渐增强,且出现较为明显的胞浆内着色(表1)。
表1 CDK4蛋白免疫组织化学染色结果
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CDK4染色 |
正常口
腔粘膜 |
上皮单
纯增生 |
上皮异常增生 |
鳞癌组 |
淋巴结转移灶 |
| 轻度 |
中度 |
重度 |
无转移 |
有转移 |
| n=10 |
n=10 |
n=10 |
n=10 |
n=10 |
n=10 |
n=10 |
n=10 |
| 染色强度平均秩和 |
胞核 |
32.4 |
30.0 |
44.4 |
58.0 |
60.0 |
48.5 |
12.2 |
10.4 |
| 胞浆 |
12.0 |
14.8 |
44.8 |
42.0 |
48.8 |
90.4 |
88.0 |
86.8 |
| 阳性细胞百分比 |
|
16.8 |
20.4 |
34.6 |
46.8 |
64.7 |
68.4 |
30.2 |
8.2 |
| SII |
24.7 |
29.3 |
100.7 |
114.4 |
198.8 |
144.0 |
24.9 |
10.3 |
在正常口腔粘膜组织中,阳性细胞数较少,散在分布于整个上皮层。少数组织中出现胞浆着色,但强度明显低于细胞核着色。上皮单纯性增生与正常口腔粘膜无显著性差异(P>0.05);上皮异常增生各组中,阳性细胞呈灶性分布,主要位于上皮棘层及部分粒层细胞胞浆或胞核中(图1)。胞核及胞浆染色强度(SII值)均较前两组增强(P<0.05),不同程度的异常增生上皮间CDK4的阳性反应无明显差别;浸润癌中CDK4胞核阳性反应显著低于其余各组,而胞浆阳性反应强度高于各组(P<0.05)。高分化肿瘤中,阳性细胞定位于癌巢外周,基底样细胞中见整齐的阳性反应信号(图2);低分化肿瘤中所有阳性反应均位于胞浆。几乎所有伴转移的口腔粘膜鳞状细胞癌均无胞核阳性反应。
责任编辑：姚红祥 |