摘要 目的:研究六亚甲基二乙酰胺(HMBA)诱导人粘液表皮样癌(MEC-1)细胞分化与细胞P53蛋白表达和细胞增殖周期的关系。方法:MTT比色法测定HMBA对MEC-1细胞体外生长的作用;Feulgen染色测定细胞DNA含量;ABC免疫酶染色检测P53蛋白;FCM法测定细胞增殖周期。结果:HMBA对MEC-1细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性;HMBA诱导的细胞与对照细胞比较,DNA含量减少,P53蛋白水平降低,G1期细胞数增加和S期细胞数减少。结论:HMBA对MEC-1细胞的诱导分化作用与其调节P53基因蛋白表达和细胞增殖周期有关。
关键词 粘液表皮样癌 六亚甲基二乙酰胺 P53蛋白 细胞增殖周期

　　作者以往对低分化型粘液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma,MEC)来源的MEC-1细胞系的分化诱导研究表明,分化诱导剂六亚甲基二乙酰胺(hexamethylene bisacetamide,HMBA)对体外培养的以及裸鼠体内移植的MEC-1细胞均有显著的生长抑制作用和分化诱导作用［1,2］。目前,对HMBA的分化诱导作用机理尚不十分清楚。本实验旨在探讨MEC-1细胞的分化与P53抑癌基因蛋白表达和细胞周期的相互关系。

1 材料和方法
1.1 分化诱导剂配制及细胞培养
　　HMBA(Sigma,美国)配制成0.5 mol/L母液,用培养液稀释至所需浓度。人粘液表皮样癌MEC-1细胞系(第四军医大学口腔生物学教研室建立)用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(GIBCO,美国),在37 ℃、5% CO2及100%湿度条件下培养。用MTT比色法［3］测定HMBA以不同浓度、不同时间和不同方式对MEC-1细胞体外生长的细胞存活分数的影响。
1.2 Feulgen染色
　　MEC-1细胞培养在含1 mmol/L的HMBA培养液或对照培养液中,4天后,取细胞铺片,按常规Feulgen染色法显示细胞核DNA,用图像分析仪定量分析其相对含量,每个样本分析100个细胞,用t检验进行统计处理。
1.3 ABC免疫酶染色
　　细胞处理及标本制备同1.2节。用鼠抗人突变型P53抑癌基因蛋白抗体(北京中山生物技术公司)及ABC试剂盒(Vector公司,美国),按常规ABC法染色,标本分析同1.2节。
1.4 流式细胞术(FCM)
　　实验分3组,加药组MEC-1细胞用1 mmol/L或4 mmol/L的HMBA体外诱导培养48小时;去药组细胞用1 mmol/L或4 mmol/L的HMBA体外诱导培养96小时,更换无药培养液培养48小时;对照组用无药培养液培养。分别用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA(1∶1)消化细胞,制备单个细胞悬液,70%冷乙醇固定,PBS洗涤,再用1% Triton X-100、0.01% RNase和0.05%PI处理,通过300目尼龙网备检。用ProfileⅡ型流式细胞仪,在488 nm激发波长下测定细胞DNA,用Multicycle软件分析细胞周期分布情况。

2 结 果
2.1 HMBA对MEC-1细胞生长的影响
　　用MTT比色法测定的结果见图1。HMBA在1 mmol/L对MEC-1细胞作用2天后开始产生抑制作用,并随着浓度增加和作用时间延长生长抑制作用更明显。在HMBA作用4天后再去药培养,MEC-1细胞逐渐恢复增殖。表明HMBA对MEC-1细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性,并具有一定的可逆性。

图1 HMBA对MEC-1细胞生长的影响
HMBA组 ○ 1mol/L,△ 2 mol/L,□ 4 mol/L
去除HMBA组 ● 1 mol/L,▲ 2 mol/L,■ 4 mol/L

2.2 HMBA对MEC-1细胞DNA含量及P53蛋白表达的影响
　　Feulgen染色标本用图像分析仪分析结果显示,MEC-1细胞在1 mmol/L的HMBA诱导4天后,细胞核平均DNA含量显著下降(表1)。

表1 HMBA对MEC-1细胞DNA及P53
蛋白水平的影响

分组	DNA()	P53()	P53阳性率(%)
对照组	183.42±6.73	183.70±8.60	16.31
HMBA组	175.54±3.91	175.72±6.00	9.71

P<0.05 　　P53抗体染色标本用图像分析仪分析结果显示,MEC-1细胞在1 mmol/L的HMBA诱导4天后,细胞抑癌基因P53蛋白水平显著下降(表1)。 2.3 HMBA对MEC-1细胞系细胞增殖周期的影响 　　HMBA诱导48小时后,处于S期的MEC-1细胞比例下降、G1期比例升高,并呈剂量依赖性。HMBA诱导96小时后去药培养48小时,MEC-1细胞各时相比例有所恢复(表2)。 表2 HMBA对MEC-1细胞细胞增殖周期的影响(%)

责任编辑：姚红祥