摘要 目的:克隆并分析人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体重链可变区基因。方法:从分泌抗
人VEGF单抗的杂交瘤细胞株(Ell)中提取总RNA,利用逆转录-PCR方法,克隆抗人VEGF单克隆抗体
(MAB)重链可变区基因(VH),将其重组入pEGMR-T Vector测序载体测序。结果:VH基因序列全长369
个碱基对,编码123个氨基酸,通过国际联机检索及Kabat库扫描证实,该VH基因符合小鼠免疫球蛋
白可变区基因特征,同源性最高达87%。结论:VH基因全长369 bp,根据Kabat分类,归属小鼠重链可
变区基因第Ⅱ(A)亚组,由VH-D-JH4重排产生。
血管内皮生长因子是1989年Ferrara［1］从牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先纯化出来,
命名为(vasoendothelial growth factor, VEGF),经测序及基因分析,发现与血管通透因子
(vascular permeability factor, VPF)是同一基因家族的同系物。目前已知VEGF能特异作用于
内皮细胞,也是作用最强的血管通透剂,能引起血管渗透性增加,促使纤维蛋白沉积于细胞外基质,
促进新生血管形成。近年来,已确认VEGF是肿瘤组织血管生成的主要调节因子,常见的恶性实体肿
瘤均有VEGF的过量表达。VEGF促进肿瘤生长已得到许多实验［2］的证实。抗VEGF单抗能抑制肿瘤
生长及转移瘤的发生［3,4］。但由于鼠源单抗在人体内易诱发人抗鼠抗体(HAMA)免疫反应而应用
受限。基因工程技术对抗体的改造(即重组抗体及抗体人源化)可降低其免疫源性,工程抗体也因
此成为国内外研究热点。单链抗体(scFv)以其分子小,穿透力强,免疫源性低,易于大量生产等优
点,得到了较为广泛的应用。本课题在建立抗-VEGF MAB杂交瘤细胞株,并实验证实其抗人VEGF单
克隆抗体(MAB)有生物学活性的基础上,拟克隆抗体可变区基因,构建scFv基因并表达。本文报道
重链可变区基因(VH)克隆测序结果。
1 材料和方法
1.1 工具酶及试剂
鸟类成髓细胞血症病毒(AMV)逆转录酶、PCR纯化试剂盒、pEGMR-T Vector(测序载体)及序列
分析试剂盒均为Promega公司产品,其余试剂为分析片(AR)和分子生物学纯。
1.2 细胞总RNA提取
抗人VEGF杂交瘤细胞株的建立见参考文献［5］,按参考文献［6］稍加改良。收获约6×107杂
交瘤细胞,离心后用裂解液裂解细胞团块,离心后上清用酚/氯仿抽提,无水乙醇沉淀。
1.3 逆转录-PCR
根据Kabat库［7］,5\'-端引物设计为互补于FR1区,5\'端为简并引物,序列为:5\'-GGGAATTCATGGAGGTG(CA)AGCT(GT)C(AT)GGAGTC-3\'。3\'-端互补于重链JH区,因小鼠JH区有4
类,故合成4条引物,序列分别为:JH1:5\'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC-
3\',JH2:5\'-TGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCC,JH3:5\'-TGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-
3\',JH4:5\'-TGAGGAGAC-GGTGACTGAGGTTCC-3\'。以10μl RNA为模板,分别以JH1-JH4为引物,在AMV逆
转录酶催化下合成cDNA,以cDNA为模板,在30μl:反应体系中,加入5\'端可变区引物,在GeneAmp
PCR System(Perlin Elmer公司产品)上进行扩增,参数设为:94℃变性60分,55℃退火60分,72℃
延伸60分,30次循环。PCR产物用1.5%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收。
1.4 重链可变区基因的克隆及序列测定
将琼脂糖凝胶电泳回收的PCR产物纯化(Qiagen,gel extraction kit)后,克隆在末端T突出的
pEGMR-T Vector中,转化感受态细菌CM1601,挑选阳性克隆,抽提质粒DNA,T7及SP6通用引物双向测
序。
2 结 果
2.1 RT-PCR扩增产物的鉴定
用RT-PCR扩增抗VEGF单抗重链可变区基因,仅JH4获得特异扩增,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴
定(图1),可观察到清晰的条带,大小在370 bp左右,与引物设计结果吻合。
图1 VH凝胶电泳结果
M：标准分子量参照
VH：扩增片段
2.2 重链可变区的克隆及序列分析
PCR产物经纯化后,克隆进T-Vector载体,用通用引物在310 A全自动DNA序列分析仪(ABI)公司
上测序结果表明,该重链可变区基因的长度为369 bp,编码123个氨基酸(图2)。
图2 抗VEGF单克隆抗体重链可变区核苷酸及其氨基酸推导序列(划线处为CDRs)
