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摘要 目的:预测血管内皮生长因子(VEGF)连续性表位,利用VEGF合成肽制备抗VEGF合成肽单克隆抗体。方法:根据VEGF189氨基酸序列,采用抗原指数方案及Goldkey软件,预测VEGF表位,确定合成肽序列,在430 A固相自动肽合成仪上合成。结果:VEGF氨基端1～26残基被确定为合成肽序列并合成。结论:VEGF抗原表位的预测与合成,为利用VEGF合成肽制备抗VEGF合成肽单克隆抗体提供了一条有效的途径。
实体瘤的生长及转移依赖新生血管的形成［1］,许多实体瘤细胞均有血管内皮生长因子(VEGF)的过量表达［2,3］。业已证明,VEGF在肿瘤血管生成过程中起关键作用［4］,利用VEGF单抗抑制VEGF活性可显著抑制实体瘤的生长［5］。但VEGF来源困难。本研究旨在利用合成肽技术,设计与合成人VEGF合成肽,为用以制备抗VEGF单抗提供一条新的有效途径。已知VEGF由于其mRNA剪接方式的不同,存在5种VEGF变异体,即VEGF121、VEGF165、VEGF145、VEGF189、VEGF206。后3种与肝素有很高亲和力,细胞分泌后直接保留在细胞膜肝素样分子上,或储存在细胞间质内,仅VEGF121、VEGF165为可溶性蛋白,易扩散到达靶细胞,与VEGF的生物学活性密切相关,两者不同之处可能是受体识别的不同,生物学性质未见有差异［6］。VEGF165的110、123、163位氨基酸为碱性氨基酸,可能与肝素结合相关［7］。因此,合成肽的设计界定在N-端1～121氨基酸内(各变异体N-端序列均与此相同)。
1 材料和方法
1.1 人VEGF189氨基酸序列
APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLM
RCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDR
ARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCK
NTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
1.2 合成肽的设计
采用抗原指数方案［8］和Goldkey软件中亲水方案、易接近度方案及蛋白质二级结构预测方案,进行综合分析、判断。
1.3 合成肽的合成、鉴定
采用固相化学合成法在430A肽合成仪(Applied-Biosystems PE公司,美国)上合成。用fmoc氨基酸为原料,采用固定羧基端向氨基端递增的方式。最后用氟化氢(HF)法切除保护基及树脂,反应2小时后,抽尽HF得脱保护基产品与树脂的混合物,以乙酸乙酯加0.1%乙酸反复萃取,分离后冷冻抽干,获得粗肽产物。用Sephadex G-10将肽与盐及保护基分开。以1%的醋酸为洗脱液,柱床体积350 ml。粗肽溶于2%醋酸,流速20 ml/h。脱盐后的粗肽用高压液相色谱法进一步纯化。反复收集HPLC中的最大峰,冷冻抽干,再经HPLC呈单峰。鉴定用Bio Focus-3000毛细电泳仪(Bio-RAD公司,美国)区带电泳法进行。氨基酸组份分析仪(Beckmen 3000,美国)上进行组份分析。
2 结 果
2.1 合成肽的设计
抗原指数方案(10残基窗口)、亲水方案(7残基窗口)、表面可及方案(7残基窗口)与蛋白质二级结构预测方案运算结果分别见图1～3,表1。结果共发现6个连续性表位,标为:P1(10～22),P2(27～36),P3(39～49),P4(66～75),P5(78～95),P6(103～112)。VEGF第75位氨基酸为谷氨酰胺,系糖基化位点,多糖可能掩盖该位点,故P4可不考虑。为增加成功率,首选N-端的P1,因末端比中间更柔韧、更亲水。结合VEGF二级结构,21～25有一β-转角,因转角常在蛋白质和多肽中作识别位点［9］,故合成肽应设计为P1 0～25,已知肽段长度与抗原性呈正比,最终合成肽确定为N-端1～26残基(26位系半胱氨酸,为与载体蛋白的共价结合点)。
表1 VEGF表位预测结果
| 方案 |
预测的抗原表位 |
| 抗原指数方案 |
10～19 |
27～36 |
40～49 |
66～75 |
82～91 |
103～112 |
| 亲水方案 |
15～21 |
31～37 |
42～48 |
|
76～82 |
91～97 |
| 易接近度方案 |
7～13 |
18～24 |
36～42 |
70～76 |
84～90 |
107～113 |
| 综合判断方案 |
10～22 |
27～36 |
39～49 |
66～75 |
78～95 |
103～112 |
图1 抗原指数方案
图2 亲水方案
图3 易接近方案
责任编辑：姚红祥 |