摘要　目的：利用金黄地鼠颊癌模型，探讨口腔癌发生过程中增殖细胞核抗原(PCNA)表达变化及其规律。方法：0.5%二甲基苯并蒽(DMBA)丙酮液处理地鼠颊粘膜，每周3次，3、6、9和12周分批处死动物；对照组不处理。利用抗PCNA单克隆抗体，免疫组化方法(LSAB)检测PCNA的表达情况。结果：正常地鼠颊粘膜PCNA表达主要位于基底层和少数棘层细胞，3周单纯增生类似正常，6～9周上皮呈不同程度异常增生，PCNA表达扩展至棘层，甚至全层，与异常增生程度呈正相关；12周鳞癌形成时，PCNA表达明显增加，且见明显异质性。结论：DMBA诱导地鼠颊癌发生过程中存在PCNA异常表达，且与癌变进展有关，提示PCNA表达可作为口腔癌变监测的生物学标志之一。
关键词　增殖细胞核抗原　口腔癌发生　金黄地鼠

　　增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)是一种36KDa的细胞蛋白，是近年来倍受关注的细胞周期调节核蛋白。它已证实是与DNA合成有关的DNA聚合酶的辅助蛋白。近年来研究发现PCNA不仅参与了DNA复制，而且也是DNA修复所必需的［1］。因而，研究肿瘤发生发展中的PCNA表达，不仅可反映细胞增殖活性的异常，而且有助于认识细胞恶变的某些遗传畸变。本文目的旨在利用金黄地鼠颊癌模型，动态地探讨PCNA在口腔癌发生中的表达规律及意义。

材料和方法

　　1.实验动物：金黄地鼠，雌雄各半，6～周龄，70～80g(由卫生部成都生物制品研究所提供)，分笼饲养，温度18～24℃，12h光暗循环。
　　2.诱癌剂：DMBA(7，12-Dimethylbenzanthracene),购自Sigma公司，用分析纯丙酮配成0.5%(W/V)溶液，避光密闭保存，用时取少量。
　　3.动物分组及处理方法：实验组48只，用0.5%DMBA丙酮液处理右侧颊粘膜，每周3次，每3、6、9周各处死12只，余下于12周处死，切取病变最明显处颊粘膜，按WHO标准，进行常规病理学评价。对照组10只不处理，实验结束时处死。
　　4.免疫组化染色方法：动物颊粘膜标本4μm切片，按免疫组化要求进行常规处理。试剂盒LSABKit和DAB为DAKO公司产品。抗PCNA单抗(PC-10)为Zymed公司产品，浓度1：50。根据LSAB Kit产品说明书进行免疫组化染色。阳性对照为人类口腔癌标本，PBS代替一抗为阴性对照。
　　结果判断：为保证染色的重复性和客观性，每张切片至少选择三个区域，高倍镜下(40×10)计数至少300个角朊细胞的阳性细胞数。阳性细胞数占总计数细胞的百分比即为标记指数，根据标记指数判断PCNA表达程度。不同组织学类型PCNA标记指数比较用t检验。

结　果

　　实验组1例动物4周时死亡，其余存活良好，各时段病变粘膜组织学评价见表1。

　　　　表1　实验组地鼠颊粘膜上皮组织学特征

周数	动物数	正 常	单纯 增生	轻度 异常 增生	中度 异常 增生	重度 异常 增生	癌
3	12	0	12	0	0	0	0
6	12	0	1	7	4	0	0
9	12	0	0	0	4	8	0
12	11	0	0	0	0	2	9
合计	47	0	13	7	8	10	9

 
　　所有标本上皮细胞PCNA染色均位于胞核，胞浆中未见染色，呈弥散或颗粒状，所有可识别的染色细胞视为阳性。正常地鼠颊粘膜PCNA阳性细胞主要位于基底层及少数棘层细胞(图1)，实验组3周单纯增生上皮PCNA阳性细胞分布类似正常颊粘膜。6～9周颊粘膜有不同程度的异常增生，PCNA阳性细胞分布有很大差异，从基底层到棘层甚至全层，与异常增生程度有关，轻度异常增生分布见于增殖的基底细胞及棘层细胞(图2)，至重度异常增生阳性细胞几乎见于全层，有异质性。12周鳞癌形成时，阳性细胞增加，以浸润癌前缘或基底样细胞阳性反应最强(图3)。不同组织学类型PCNA标记指数比较(图4)显示，除正常［(22.8±4.8)%］与单纯增生［(27.4±7.8)%］，重度异常增生［(81.85±16.8)%］与鳞癌［(84.8±22.2)%］外，其余各组［其中中度异常增生为(42.3±11.8)%］间统计学有差异(P<0.05)。表明随恶变进展，PCNA表达逐渐增加。

责任编辑：姚红祥