[摘要]  目的  建立人颌下腺腺上皮细胞的原代培养模型。方法  取口腔癌患者未受累及的颌下腺组织块，采用机械法和消化法，在10％血清浓度下，分别加入EGF,胰岛素、转铁蛋白等附加因子，37℃，5％Co2开放培养。选用苏木精—伊红、PAS染色及S—P法免疫组化染色，扫描及透射电镜观察等方法研究其生物学性状。结果  通过特殊染色、免疫组化、电镜观察证实了体外培养细胞的腺上皮属性，细胞在4d内可保持分化状态和分泌功能，可存活1周以上。结论  成功建立了人颌下腺腺上皮细胞体外原代培养的模型。
[关键词]  颌下腺腺上皮细胞；细胞培养；人
[中图分类号]  R 329．24    [文献标识码]  A    [文章编号]  1003-9872(2003)01-0017-03
    颌下腺腺上皮细胞是高度分化的上皮性细胞，在体外难以长期存活和保持分化状态，因此，本研究除选用促生长因子外，还使用其他因子，如睾丸酮、二巯基乙醇、TPA等。人颌下腺腺上皮细胞系的建立，可为今后研究涎腺肿瘤性疾病及非肿瘤性疾病的发病机制和药物治疗提供实验模型。
1材料与方法
1．1  材料
    DMEM、HamFl2培养基(Cibco)、Ⅱ型胶原酶、HEPES，S—P免疫组化药盒(Sigma)，角蛋白、波形蛋白、溶菌酶抗体(Zymed)、胰蛋白酶、小牛血清、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸盐、氢化可地松、异丙肾上腺素、ECP、二巯基乙醇、佛波酯(TPA)、睾丸酮、PGEl、青霉素、链霉素等。超净工作台、C02培养箱(FisherScientific)、倒置相差显微镜(0LYMPUS PM—10AD)等。
1．2  培养方法
    选择30—60岁的口腔癌患者，行颈部淋巴结清扫术，病理证实颌下区无转移者，取颌下腺组织，在无菌条件下切取深部腺体，以小弯剪剪碎至0．5mm3大小的组织块，0．25％胰蛋白酶+EDTA在4℃冷消化后，再加入2 000U／mIⅡ型胶原酶消化。待细胞大部分离散时，经100mm滤网过滤收集，在无菌的Ficoll液中离心，收集中段细胞，台盼蓝染色活细胞计数，以4X10 5／mI接种于24孔塑料培养板中(0．5ml/孔)，5％C0 2—37℃开放培养。每隔24h，1／4量换液，轻轻吸附细胞碎片，加入部分含有异丙肾上腺素的新培养液，第3天，半量换液。
    基本的培养液为DMEM：F12二1：1，15 mmOlHEPES液，加入胰岛素5g／L，亚硒酸盐5ng／mI，转铁蛋白5mg／ml，氢考100ng／mI，ECP 36ng／mI，异丙肾上腺素2mg，青霉素100U／ml，链霉素100g／L，调整pH值到7．0。
    在培养液中调整以下培养条件，①小牛血清5％、10％、15％。②加入或不加入二巯基乙醇、睾丸酮、TPA、PECl，用细胞是否能生长分化为判断标准，选择最适培养条件。
1．3  检测方法
    用倒置显微镜进行活细胞的形态学观察，拍照记录培养细胞生长的情况。
    取第4天的培养细胞，0．25％胰蛋白酶消化收集，10％中性甲醛固定。分别进行苏木精—伊红染色、PAS染色，以角蛋白(Cytokeratin)、波形蛋白(Vi-mentin)、溶菌酶(Lysozyme)抗体进行免疫组化染色。
    取第4天的生长良好的培养细胞，用2．5％戊二醛／PBS液直接在培养孔内固定，收集细胞，再加人2．5％戊二醛固定12 h。二甲砷酸缓冲液中浸泡过夜，1％锇酸固定乙醇、丙酮梯度脱水。EPON812包埋，聚合，超薄切片机切取60Bin厚，柠檬酸铅、醋酸铀重金属染色，透射电镜下观察。
    用2．5％戊二醛固定的标本，二甲砷酸缓冲液过夜，乙醇、丙酮梯度脱水，乙酸异戊酯置换，C0 2干燥，真空干燥喷金，扫描电镜下观察。

2  结果
2．1  培养条件
    最后确定的最适培养条件如下：10％小牛血清胰岛素5g／L，亚硒酸盐5ng/mI，转铁蛋白5g／L，氢考100ng／mI，EGF36ng／mI，异丙肾上腺素2mg，二巯基乙醇10mmol，睾丸酮10ng／mI，PEGl 10ng／mI，TPA5ug／mI。

责任编辑：姚红祥