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[摘要] 目的 探讨外源野生型PTEN抑癌基因对人高转移性黏液表皮样癌细胞系M3SP2体外黏附、迁移和侵袭特性的影响。方法 用脂质体介导方法将FrEN抑癌基因导人M3SP2细胞系(M3SP2—PTEN细胞)，转染空载体的细胞系作为对照(M3SP2—pBp细胞)，分别用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、细胞迁移试验及细胞侵袭试验测定M3SP2—PIEN细胞和M3SP2—pBp细胞体外黏附、迁移和侵袭能力。结果 M3SP2—PTEN细胞在Metrigel和Fn基质上黏附数量减少，与对照组比较差异有显著性(P<0．01)，黏附抑制率分别为34．3％和49．4％。M3SP2—PTEN细胞在Matrigel基质上迁移距离小，与对照组比较差异有显著性(P<0．05)，迁移抑制率为26．0％。M3SP2—PTEN细胞体外侵袭细胞数量减少，与对照组比较差异
有显著性(P<0．01)，侵袭抑制率为31．4％。结论 外源性PTEN抑癌基因对高转移性黏液表皮样癌细胞系M3SP2体外黏附、迁移和侵袭具有抑制作用。
[关键词] PTEN抑癌基因；黏液表皮样癌
FTEN(phosphatase and tensin homology deleted On chromosome 10，PTEN)基因是近年来发现的一种新的抑癌基因，许多研究表明，将野生型PTEN基因导人脑胶质瘤、子宫内膜癌等恶性肿瘤细胞，产生显著的抑癌效应「1,2」，有望成为治疗肿瘤的候选基因。黏液表皮样癌是一种常见的涎腺恶性肿瘤，其中低分化型肿瘤具有侵袭性强、转移率高、预后差的特点「3」。本实验首次探讨外源性野生型PTEN抑癌基因对高转移性黏液表皮样癌细胞系M3SP2体外黏附、迁移和侵袭的影响。
1 材料和方法
1．1 材料
人工重构基膜材料Matrigel(美国C0llaborative Rsearch公司)，纤维连接蛋白(Fn，美国Sigma公司)，小牛血清白蛋白(BSA，华美生物工程公司)，四甲基偶氮唑蓝(MTT，美国Sigma公司)，96孔培养板(丹麦NUNC公司)，用于细胞侵袭试验的培养小室Transwell(孔径8 um，美国Costar公司)。
1．2 方法
1．2．1 基因转染及细胞培养 参照文献[4]，用脂质体介导方法将含野生型PTEN抑癌基因逆转录病毒载体导入内源野生型PTEN抑癌基因表达缺失的M3SP2细胞系(简记为M3SP2—PTEN细胞)，转染逆转录病毒空载体的细胞系作为对照(简记为M3SP2—pBp细胞)。细胞用体积分数为10％胎牛血清的RPMl l640培养液(美国Gibco公司)，在37℃、体积分数为5％ C02及饱和湿度条件下培养。
1．2．2 细胞黏附试验 参照文献方法并加以改良「5，6」，主要实验步骤如下：将10 g／L BSA、50mg／LMetrigel l：8稀释液以及10 mg／L Fn分别以50 ul/孔各自加入96孔培养板，4℃包被基膜过夜。次日水化基膜，即吸出残余液体，每孔加入50 ul含10 g／LBSA的无血清培养液，37 ℃孵育1 h。消化M3SP2—pBp细胞和M3SP2—PTEN细胞，以1X10 5／mL细胞密度，分别将100 uL细胞悬液接种于包被BSA、etrigel和Fn的96孔培养板中，每组平行4个样本。用含10 g／L BSA和体积分数为1％胎牛血清的RPMl l640培养液分别在37 ℃培养1 h后，按MTT比色法测定各孔细胞的吸光度值(A值)，以BSA组贴壁细胞A值为参照，分别按公式计算Metrigel和Fn组中M3SP2—pBp和M3SP2—FFEN细胞黏附率。以对照细胞M3SP2—pBp为参照，分别计算M3SP2—PTEN细胞在人工基膜Metrigel和Fn上的黏附抑制率。
黏附率(％)=[(实验组细胞A值／BSA组细胞A值)—1]x100。
黏附抑制率(％)=[1—(M3SP2—PTEN组黏附率／M3SP2—pBp组黏附率)]x100。
1．2．3 细胞迁移试验 参照文献方法并加以改良「7」，主要实验步骤如下：在96孔培养板中包被Metrigel，方法同细胞黏附试验。以5X10 5／ml细胞密度，分别将100uL M3SP2—pBp细胞和M3SP2—PTEN细胞悬液接种于包被Metrigel的96孔培养板中，每组平行4个样本，用体积分数为10％胎牛血清的RPMI 1640培养液常规培养，直至形成细胞单层。在培养板底部单层培养细胞上呈“一”字形划痕，用无血清培养液洗涤1次，更换含10g／L BSA和体积分数为1％胎牛血清的RPMl 1640培养液，然后，显微镜下测量划痕区相对距离。培养24 h后，更换体积分数为10％胎牛血清的RPMl 1640培养液，继续培养24 h后，显微镜下测量细胞向致伤区迁移的相对距离。根据原始细胞致伤区距离计算出细胞实际迁移距离。以M3SP2—pBp细胞为对照，按公式计算M3SP2—FYEN细胞迁移抑制率。
责任编辑：姚红祥 |