【摘要】　目的　为了解MTS1基因变异在头颈部肿瘤发生发展中的作用。方法　采用多重PCR技术扩增MTS1基因外显子2。结果　本组MTS1基因外显子2纯合子缺失的频率为37.3%(17/45)，分化较好鳞癌MTS1基因缺失频率31.5%(6/19)明显低于分化较差的鳞癌的57.1%(8/14)，但差异无显著性(P>0.05)。结论　本研究提示MTS1基因变异与头颈部恶性肿瘤的发生发展有关。
　　【关键词】PCR　　MTS1基因　　头颈部肿瘤

　　多肿瘤抑制基因(MTS1)是美国科学家Kamb［1］在1994年克隆的一种新的抑癌基因，定位于人染色体9p21区，由2个内含子及三个外显子组成，中间307bp编码序列组成外显子2，MTS1基因编码的产物p16蛋白是细胞周期的负调控因子，当MTS1因缺失或突变而不能正常表达时，细胞增殖则失去控制甚至发生癌变。我们应用多重PCR技术对45例头颈部肿瘤组织中MTS1基因外显子2进行了扩增检测，现将结果报告如下。

材料和方法

　　本组共45例，其中舌癌9例，颊癌5例，牙龈癌4例，唇癌3例，涎腺各型癌11例，其它13例(包括6例良性肿瘤及囊肿)。年龄14～78岁，年龄中位数50岁，男性27例，女性18例。由桂林医学院附院口腔科及病理科采集头颈部肿瘤及其相应正常组织，-20℃冷冻保存以备提取DNA，所有病例均经病理证实。
　　试剂：蛋白酶K(Merck公司)；PCR扩增试剂(华美生物工程公司北京分公司)；引物(美国生命公司合成)。
　　DNA提取：组织切碎PBS中匀浆后，加入含SDS的细胞裂解缓冲液，同时加入蛋白酶K(终浓度为200μg/ml)，55℃水浴过夜，DNA采用常规的酚-氯仿抽提，无水乙醇沉淀，TE溶解备用。
　　多重PCR：按照引物设计的原则，经软件分析，设计两对特异性引物，分别扩增MTS1基因外显子2和β-globin基因，其中β-globin基因作为对照扩增，引物序列分别如下：①人β-globin基因：P1：5’-gttggccaatctactcccag-3’　P2：5’-gctcactcagtgtggcaaag-3。②MTS1基因EXON2　P3：5’-caggtcatgatgatgggcag-3’；P4：5’-ctgagggaccttccgcggcatc-3’。PCR扩增按作者方法进行［2］，反应总体积为50μl，包括：10×PCR buffer,5μl；dNTPs，5μl；primer 1(MTS1 exon 2),2μl;primer 2(β-globin gene),2μl;模板DNA，5μl；Taq DNA聚合酶，1U；加H2O至50μl，混匀，上覆盖石蜡油，94℃变性5min，经30周期循环(94℃ 40s，55℃ 30s,72℃ 90s)后，再72℃延伸5min。取扩增产物10μl在2%琼脂糖凝胶电泳50分钟，于紫外透射仪下观察照相。MTS1基因外显子2扩增片断为310bp,β-globin基因扩增产物为536bp。

结　　果

　　多重PCR在正常组织中全部扩增到MTS1基因，在头颈部肿瘤中检出37.7%(17/45)MTS1基因外显子2纯合子缺失(附图)；其中6例良性肿瘤及囊肿未检出MTS1基因缺失，6例腺癌中3例MTS1基因缺失，33例鳞癌中14例MTS1基因缺失；分化较好鳞癌(Ⅰ～Ⅱ级)MTS1基因缺失频率31.5%(6/19)，明显低于分化较差鳞癌(Ⅱ～Ⅲ级)的57.1%(8/14)，但差异无显著性(P>0.05)。男性MTS1基因缺失占40.7%(11/27)，略高于女性33.3%(6/18)，但亦无显著性差异(P>0.05)。

图1　多重PCR扩增头颈部肿瘤中MTS1基因外显子2电泳图谱
　　M：PCR Marcker(PGEM-3ZF(+)/Hae Ⅲ)；N：正常组织；T1：MTS1基因外显子2未发生缺失的肿瘤；T2、T3：MTS1基因外显子2发生缺失的肿瘤

讨　　论

　　Nobori［3］等报道，75%的肿瘤细胞系中MTS1基因缺失。在皮肤、膀胱、食道等部位的原发肿瘤中也发现有不同程度的MTS1基因缺失或突变［4］。Yeudall等［5］用PCR技术检测了14例口腔鳞状细胞癌细胞系中的MTS1基因变异情况，结果其中8例有明显的MTS1基因缺失，余下的6例虽可表达正常的p16蛋白的mRNA，进一步研究发现，其基因结构中第2～16碱基对亦有缺失出现。本文结果检出37.7%的肿瘤有MTS1基因外显子2纯合子缺失，而正常组织中MTS1基因都正常扩增，提示MTS1基因变异与头颈部肿瘤的发生有关。检测结果还显示，良性肿瘤及囊肿中未检出MTS1基因缺失，而腺癌及鳞癌都检出MTS1基因缺失，其中分化较好的鳞癌MTS1基因缺失的频率明显低于分化较差的鳞癌，但差异无显著性(P>0.05)，提示MTS1基因变异与肿瘤的恶性程度也有一定关系。男性患者MTS1基因变异的频率略高于女性患者，这可能与男性嗜好烟、酒，口腔癌本来以男性多发有关。

责任编辑：姚红祥