【摘要】　目的　探讨胶原蛋白凝胶作为颊癌细胞在 体外培养环境下生长和浸润模型的价值。方法　从鼠尾肌腱中提取出 较纯的Ⅰ型胶原蛋白，制成胶原蛋白凝胶体，将建株人颊癌细胞置于其中培养生长，从形态 学特征上初步探讨胶原蛋白凝胶模型的价值。结果　从鼠尾肌腱提取 的Ⅰ型胶原蛋白，能形成胶原蛋白纤维束网状结构-胶原蛋白凝胶；其内生长的颊癌细胞所 处的生长环境，类似于机体内的生长环境，颊癌细胞有很高的生长率。结论鼠尾肌腱胶原蛋白凝胶，能制成理想的肿瘤细胞的生长及浸润模型；建株颊癌细胞能 在立体胶原凝胶中生长，保持着细胞原有的形态特征及生物学特性。
　　【关键词】　胶原蛋白　　肿瘤细胞　　培养　　浸润

　　在传统的贴壁单细胞层培养法中，颊癌细胞仅是沿着一个平面生长 。据报道［1］：这种单层的平面生长不利于细胞形态的展现，影响了细胞结构的完 整性。这种细胞结构性的丧失，又影响了癌细胞的一些特异性表达。其与机体内生长的立体 环境有着明显的区别。本实验利用提纯的胶原蛋白，制成立体的胶原蛋白网状结构，模拟机 休内的立体状况，将颊癌细胞BCaCD885接种于胶原凝胶表面及内部，直观地评价胶原蛋白凝 胶立体生长模型的价值。

材料和方法

　　1.细胞来源：颊癌细胞为华西医科大学口腔中心实验室所建株的人颊癌细胞( BCaCD885)。将培养瓶内贴壁生长的颊癌细胞，用0.1%胰蛋白酶消化下来，制成约1×10 4cells/cm2浓度的颊癌细胞悬液待用。选用成纤维细胞作为颊癌细胞的对照。成纤维细 胞培养取材于一个8月患儿唇部组织。将组织块立即带回实验室，用含有双抗的生理盐水及H and’s盐溶液冲洗组织块10次以上。用剪刀修成约1mm3大小组织块，再用0.1%胰蛋白 酶消化10～20分钟，用培养液湿润，置于30ml培养瓶内原代培养。培养成活后，传代4代以 上，将成纤维细胞制成约1×104cells/cm2浓度悬液待用。
　　2.将颊癌细胞及成纤维细胞分别置于胶原蛋白凝胶表面及立体胶原蛋白凝胶内部培养。
　　胶原凝胶表面培养：分别取2ml已制备的胶原溶液与2ml对半浓缩的培养液(RPMI1640+15%小 牛血清+双抗)在10瓶30ml培养瓶中混匀，2MNaOH调PH至7.2，置入37℃恒温箱内1小时以 上，即凝固形成凝胶块。其内部超微结构及物理性能见参考文献［2］。在胶原凝胶 表面分别分瓶接种颊癌细胞及成纤维细胞。
　　立体胶原凝胶内部培养：分别取2ml已制备的胶原溶液与2ml对半浓缩的培养液在10瓶30ml培 养瓶中混匀，调好PH值为7.2。在胶原溶液凝成凝胶前，分别分瓶加入颊癌细胞及成纤 维细胞混匀。再置于37℃恒温培养箱内1小时以上，即形成了立体的胶原凝胶生长模型。
　　上述凝胶制作完成后，即加入适量的RPMI1640培养液，在37℃培养箱内培养，3天更换培养 液一次，培养时间为2周。培养瓶内颊癌细胞和成纤维细胞分别贴壁培养各5瓶，也各在2、4 、6、8、10天进行处理，细胞计数作为参照。
　　3.颊癌细胞及成纤维细胞生长曲线的测定：培养2、4、6、8、10天各取1瓶进行细胞计数 。胶原凝胶表面及内部培养组加入0.3%胶原酶消化5小时，完全溶解胶原蛋白，在300g 离心力作用下离心15～20分钟。沉淀细胞收集置于计数板上计数。贴壁培养组加入0.1% 胰蛋白酶消化10～30分钟，分离细胞，离心收集并计数。
　　4.观察方法：细胞生长情况用倒置相差显微镜进行观察。培养结束后，将胶原蛋白凝胶卷 成圆筒状，用10%福尔马林固定，常规石腊切片(厚度5μm)HE染色，光镜观察。

结　　果

　　1.颊癌细胞生长方式：颊癌细胞和成纤维细胞在胶原凝胶培养系统中生长，被分 别分为三种：①单纯培养瓶内贴壁生长；②在胶原凝胶表面生长；③在胶原凝胶内部生长。 分别分为20个培养瓶，在2、4、6、8、10天各进行处理，进行细胞计数。如表1示：贴壁培 养组和胶原凝胶内部培养组，细胞生长曲线相近，而胶原凝胶表面组稍低。相比较，如表2 示：贴壁培养的成纤维细胞有较高的生长率。而胶原凝胶系统培养相对较低。

责任编辑：姚红祥