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［摘要］ 目的：比较口腔鳞癌同一患者的肿瘤浸润淋巴细胞(tumjor infiltrating lymphocyte, TIL)和转移性淋巴结细胞(metestatic lymph node lymphocyte, MLNL)的增殖能力及表型特征。方法：从7例口腔癌原发灶及其转移灶中分离TIL和MLNL，与rIL-2共培养，观察两种来源的淋巴细胞的增殖能力，用FACS检测细胞表型。结果：60%的淋巴细胞在培养的4～5周可扩增10-100倍，6例＞100倍。MLNL 较TIL扩增高峰延迟1周，MLNL培养4周后仍显示其强有力的扩增潜力。新鲜分离MLNL和TIL以CD+3、CD+4、CD+8为主。MLNL中NK较TIL中少，CD+4/CD+8分别为1.24和1.19。培养4周后，CD+3、CD+4、CD+8均增多，但CD+8增加比例较CD+4大，CD+4/CD+8比分别为：0.95和1.08。结论：口腔鳞癌MLNL较TIL具有更强的增殖潜力。
［关键词］ 口腔肿瘤； 淋巴结细胞； 表型
口腔鳞癌与肿瘤原位细胞介导的免疫异常有关。口腔鳞癌患者的免疫抑制常较其它恶性肿瘤更为严重［1，2］。宿主和肿瘤免疫关系极为复杂，个体间、转移灶和原发灶均存在各种异质性［3］。关于口腔鳞癌原位口腔鳞癌肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)［4］和引流淋巴结细胞的特性［5］已有报道。但尚未见有将口腔鳞癌同一患者的TIL和转移性淋巴结细胞(metestatic lymph node lymphocyte, MLNL)的增殖能力及表型特征进行比较研究的报道。本部分拟对此进行探讨。
材料与方法
一、标本来源
1997.3～1998.2月在我院手术，经病理证实的口腔鳞癌伴颈淋巴结转移7例，男4例，女3例，平均年龄55岁。其中牙龈癌2例，舌癌2例，颊癌3例。
二、方法
1. 淋巴细胞的分离与培养
用酶消化和不连续梯度密度的淋巴细胞分离液将肿瘤细胞和淋巴细胞分离。用10%胎牛血清的RPMI-1640培养液调节细胞浓度为2～5×108/L,按1×106u/L, 加入rIL-2,置37℃，5%CO2培养箱中，每隔3～4d调整细胞浓度，并补充rIL-2以维持培养浓度。用台盼兰鉴定活细胞。
2. 细胞表型分析
① 取5×104/100μl的淋巴细胞，按适当比例加入异硫氰荧光素FITC和藻红蛋白PE双标的CD3、CD4、CD8、CD56单克隆抗体(BDco，USA)对照组不加单抗；② 室温避光25min；③ 洗涤三次，5ml 1%PFA固定30min；④ 上FACS检测。
结 果
一、TIL和MLNL活力及增殖
TIL活力均＞92%。TIL在培养的24h内即开始聚集成团块，多呈悬浮生长。第5-7d数目显著增加。MLNL第4周才达增殖高峰，而TIL第3周即可达增殖高峰。第4-5周TIL增殖变缓，有的细胞开始皱缩、碎裂、死亡，而MLNL显示继续强劲增殖的趋势。TIL和MLNL增殖比较见图1。60%的淋巴细胞在培养的第5周可扩增10-100倍，6例＞100倍。
二、口腔鳞癌TIL和MLNL表型比较
新鲜分离TIL和MLNL以CD+3、CD+4、CD+8为主，CD+56较少，MLNL中NK较TIL中少。CD+4/CD+8分别为1.19和1.24，经培养4周时，CD+3、CD+4、CD+8均增多，但CD+8增加比例较CD+4大，CD+4/CD+8比分别为：1.08和0.95，NK细胞也有一定的增加，分别为11%和9%。
图1 7例口腔鳞癌TIL和TDLNL增殖的比较
讨 论
过继免疫治疗中，转输足够的TIL的细胞数是获得较好疗效的重要因素［6］。MLNL是已浸润了肿瘤细胞并产生免疫应答的淋巴结，它主要由APC和免疫活性细胞组成。Tuttle等研究表明，MLNL经体外短期激活和扩增就能用于治疗。本研究却表明，MLNL增殖较TIL增殖延迟。这与Whiteside的结果相似。造成这种差异的原因可能有以下几点：①分离和培养条件的不同；②侵入到淋巴结中的肿瘤细胞对淋巴细胞抑制程度的不同；③在培养的初期MLNL对IL-2的反应不如TIL敏感，但是MLNL对rIL-2初期敏感性降低的原因尚不清楚。但 4～5周后TIL增殖变缓，而MLNL仍显示继续强劲增殖的趋势，说明MLNL具有更强的增殖潜力。
TIL是存在于肿瘤间质中以T细胞为主的异质性淋巴细胞群。不同的肿瘤，不同的个体以及同一个体在肿瘤发展的不同阶段，其浸润淋巴细胞群体的组成可能不同，而T细胞群中，不同亚群的T细胞执行各自不同的功能。因此，研究TIL的表型特征具有重要的意义。本研究结果显示，新鲜分离的TIL以CD+3为主，占63-71%，其次为CD+4、CD+8 ，均比廖贵清报道的结果高，到第3周时CD+3、CD+4、CD+8均有增加,但以CD+3和CD+8为主。MLNL和TIL相比，MLNL中CD+4较多，CD+4/CD+8比TIL 大， 说明转移灶中的免疫抑制状态可能较原发灶强。
责任编辑：姚红祥 |