1.8　统计学处理方法
　　采用Spearman相关分析。

2　结　果

2.1　cyclin D免疫组织/细胞化学染色结果
　　当细胞核内有弥漫性分布或棕黄色颗粒着色时即认为是cyclin D蛋白阳性(图1)。cyclin D单克隆抗体标记后，经免疫组化染色，42例舌癌中有33例显示cyclin D阳性表达（78.6%），其中“+”9例，占21.4%；“++”11例，占26.2%“+++”13例，占31.0%。对Tca8113细胞而言，90%的胞核中有较强的棕黄色颗粒，表明该细胞核内有较丰富的cyclin D蛋白。

图1　舌癌组织中cyclinD 蛋白合成胞核着色(ABC法 ×132)

2.2　组织/细胞cyclin D原位杂交结果
　　当细胞核中出现紫蓝色颗粒时，即被认为阳性杂交信号，表明有cyclin D基因mRNA过表达(图2)。本实验中cyclin D探针经随机引物标记原位杂交后显示，42例舌癌标本中，有28例cyclin D表达阳性（66.7%），其中“+”7例，占16.7%；“++”9例，占21.4%；“+++”12例，占28.6%。DNA呈紫蓝色团块，cyclin D在癌细胞中的表达具有异质性，鳞癌的cyclin D多位于癌巢的外层，从癌巢外层向巢内扩展，有时可见整个癌巢着色，阳性染色亦深浅不一。在体外培养的Tca8113细胞中，80%的胞核上分布有紫蓝色颗粒，表明该细胞中cyclin D基因转录增强。

图2　舌癌组织中CyclinD基因转录癌巢着色 (ISH ×33)

2.3　cyclin D基因表达和蛋白合成与肿瘤病理学分级
　　见表1

表1　舌癌中cyclin D蛋白合成和基因转录的表达与肿瘤分级的关系
 

分化程度	例数	cyclin D蛋白合成				cyclin D 基因转录
		+	++	+++	阳性率(%)	+	++	+++	阳性率(%)
高度分化(Ⅰ)	21	7	4	5	76.2	6	2	5	62.0
中度分化(Ⅱ)	13	1	6	3	77.0	1	5	3	69.2
低度分化(Ⅲ)	8	1	1	5	87.5a	0	2	4	75.0b
合　计	42	9	11	13	78.6	7	9	12	66.7

a与I比较P<0.05 ；b与I比较P<0.05 2.4　cyclin D基因表达和蛋白合成与淋巴结转移的关系 　　cyclin D标记指数与舌癌有无淋巴结转移呈正相关。见表2。 表2　舌癌中cyclin D蛋白合成和基因转录的表达与淋巴结转移的关系

2.5　舌癌中cyclin D 基因转录和蛋白合成的关系
　　凡是有cyclin D基因转录的病例，亦有cyclin D蛋白合成，但有5例cyclin D 蛋白呈阳性表达，而cyclin D mRNA 表达为阴性。两者的吻合率为82.1%。
3　讨　论

　　癌变是多个癌基因与抑癌基因协同作用的结果，其过程和机制十分复杂，至今尚未弄清。因此，目前尚缺乏有效的治疗措施。随着分子生物学的发展，越来越多的研究发现，细胞周期调控异常将引起肿瘤的发生，且肿瘤的恶性程度主要是由肿瘤细胞的增殖活性决定的。许多研究已证实细胞周期蛋白在多种人类恶性肿瘤中的表达增加，如乳腺癌、头颈部鳞癌、食管癌、肺癌等。Dutta等〔4〕发现cyclins的阳性率与肿瘤的增殖有相关性，曾将cyclins作为肿瘤扩增的标记。
　　cyclins是在海洋无脊椎动物早期胚胎细胞分裂过程中发现的，D型cyclins在cyclins家族有不同寻常的一面，它们能被外源生长因子调节，被认为是限制G1期进程最重要的调控因子。在G1期，cyclin D可被促细胞分裂剂诱导其过度表达，从而缩短G1期间隔，减少细胞数量，降低细胞对促细胞分裂剂的依赖性〔5〕。由此可见，D型细胞周期蛋白的基本作用是将一些细胞外信号与细胞周期机制结合起来。一般认为肿瘤分化越低，增殖力越强，恶性程度越高。因此，本研究依此将舌癌组织分为高度分化、中度分化和低度分化三个组别，分别应用免疫组化和原位杂交检测了42例舌癌标本以及细胞系中cyclin D蛋白合成和基因转录情况，结果均显示：细胞分化差的舌癌组织较分化程度好的表现出更强的胞核染色，表明分化越差基因转录和蛋白合成水平越高，基因表达与肿瘤恶性程度正相关，提示cyclin D能够作为判定舌癌细胞恶性程度的一个重要参数；同时实验结果也显示cyclin D标记指数与舌癌有无淋巴结的转移呈正相关性，由此可以根据cyclin D的阳性检出率来预测舌癌是否有转移的可能。

责任编辑：姚红祥