摘　要：目的：探讨磁导向甲氨蝶呤缓释药物(FM-MTX)对人口底癌HSC-2细胞生长及细胞超微结构的影响。方法：对照组为不加药物处理组，实验组加入剂量为100 μg/L的FM-MTX药物处理，采用MTT法观察HSC-2细胞的生长曲线，并分别于不同时间(1,4,24,48,72 h)收获细胞，透射电镜观察各时间点细胞的超微结构变化。结果：FM-MTX药物处理后，口底癌HSC-2细胞生长明显受到抑制；透射电镜观察到药物作用早期，瘤细胞溶酶体大量增生，4 h后瘤细胞胞浆溶酶体开始吞噬磁性微粒，48 h溶酶体膜开始裂解，颗粒释放到胞浆内。72 h后溶解、液化，溶酶体膜消失，呈现胞浆空泡结构。线粒体和内质网肿胀、缺嵴、断裂。结论：甲氨蝶呤缓释药物能诱导口底癌HSC-2细胞死亡，对其有明显的杀伤作用。其作用机制尚需进一步研究。
关键词：甲氨蝶呤；缓释制剂；口底；癌；超微结构

　　磁导向甲氨蝶呤缓释药物(简称FM-MTX)是通过化学交联制得的磁性甲氨蝶呤白蛋白缓释针剂〔1〕。它具有明显的抗肿瘤作用，能抑制舌癌Tca8113细胞从G1期进入S期，使S期进展延缓，从而导致G1期比例增加，并出现细胞凋亡〔2〕。体内治疗，通过外加磁场的靶向定位，对裸鼠移植瘤有明显的抑制作用〔3〕。本实验通过药物作用不同时间细胞电镜切片，观察FM-MTX对人口底癌HSC-2细胞生长及细胞超微结构的影响。

1　材料与方法

1.1　细胞系及细胞培养
　　人口底鳞癌细胞系HSC-2，由第四军医大学口腔医学院细胞生物教研室提供。在37 ℃ φ(CO2)=5%及饱和湿度条件下，含体积分数φ=15%的小牛血清的RPMI1640(GIBCO)培养液中培养。
1.2　药物
　　磁导向甲氨蝶呤缓释药物FM-MTX，是通过化学交联法制得〔1〕。分装后备用，用完全培养液稀释。
1.3　FM-MTX对HSC-2细胞系细胞增殖的影响
　　取生长旺盛的HSC-2口底癌细胞接种于96孔板，同时种6块板，培养24 h后，加药FM-MTX及游离MTX，并设立加外磁场(M+)和不加外磁场(M-)对照及空白对照组。药物质量浓度为100 μg/L，每组设立4个平行孔。分别在加药后第1，2，3，4，5，6 d各取一块培养板加入MTT PBS 溶液，采用MTT法检测各孔光吸收值A490。以时间为横座标，以相对光吸收值A490为枞座标，分别绘出4种细胞在FM-MTX 及MTX两种药物作用下的生长曲线。方法见文献〔4〕。
1.4　FM-MTX进入瘤细胞后超微结构观察
　　HSC-2口底癌细胞传至中号培养瓶6瓶，培养24 h后，取5瓶，每瓶加入FM-MTX100 μg/L，继续培养，分别于1、4、24、48、72 h收获细胞，透射电镜观察FM-MTX药物颗粒进入瘤细胞的内在化过程。

2　结　果

2.1　FM-MTX对人口底癌HSC-2细胞增殖的影响
　　MTX法每天检测FM-MTX及游离MTX在加外磁场(M+)、不加外磁场(M-)持续作用1～6 d时，人口底癌HSC-2细胞的增殖状况如图1所示。从图中可以看出，从第3 d起FM-MTX及MTX已表现出明显的细胞抑制作用，随着时间增加，抑制作用加强。
2.2　透射电镜观察
　　对照组HSC-2细胞连接紧密，桥粒、半桥粒结构较多。加入FM-MTX药物组，1 h后，透射电镜下可见瘤细胞内溶酶体大量增生，胞浆内分泌小泡较多。溶酶体内尚未见到FM颗粒的沉积(图2)。多数细胞核呈椭圆形，部分核出现较规则的肾形。药物处理4 h后可见溶酶体内有吞噬的FM超微磁粒；瘤细胞胞浆线粒体肿胀、增多，内质网扩张，胞浆糖原颗粒增多。(图3)。24 h则见溶酶体明显增大，FM颗粒增多(图5)。48 h溶酶体膜裂解，胞浆内可见磁微粒(图6)。线粒体肿胀明显，内摄磁性颗粒。线粒体膜裂解，内质网断裂(图4)。72 h后磁微粒释放于胞浆外(图7)。细胞连接稀松，桥粒、半桥粒结构少见。细胞体积缩小。

图1　FM-MTX及MTX在加外磁场(M+)和不加外磁场(M-)作用下对HSC-2细胞生长增殖的影响

图2　HSC-2细胞溶酶体大量增生，胞浆内分泌小泡较多。(TEM×12K)

图3　胞浆线粒体肿胀、增多，内质网扩张，胞浆糖原颗粒增多。(TEM×10K)

责任编辑：姚红祥