【摘要】　目的　研究8-MOP与ATRA联合应用对Mc3细胞膜表面凝集素受体表达的影响。方法　免疫组织化学染色方法。结果　对照组凝集素受体表达分别为：PNA(+～++)，UEA(-～++)，SBA(+～++)，RCA(+～++)；8-MOP组凝集素受体表达分别为：PNA(-～++)，UEA(+)，SBA(+)，RCA(+～++)；ATRA组凝集素受体表达分别为：PNA(-～++)，UEA(+)，SBA(+～++)，RCA(+)；8-MOP+ATRA组凝集素受体表达分别为：PNA(-～++)，UEA(+)，SBA(-～+)，RCA(+～++)。结论　PNA，UEA，SBA和RCA染色强度的下降或增高可能提示肿瘤倾向于良性分化。
　　【关键词】　8-甲氧基补骨脂素　　全反式维甲酸　　粘液表皮样癌　　凝集素

　　细胞膜表面有许多糖蛋白，而细胞膜表面糖类复合物的变化对肿瘤细胞的转移与浸润有重要影响，凝集素能与细胞膜表面特异性的糖蛋白结合，因此，可以通过凝集素对细胞膜表面糖类复合物的变化进行研究。本文研究了8-甲氧基补骨脂素(8-MOP，8-methoxypsoralen)与全反式维甲酸(ATRA，all trans retinoic acid)联合应用对粘液表皮样癌处理以后，细胞膜表面凝集素受体的变化。

材料和方法

　　1.细胞系：人粘液表皮样癌MEC-1细胞系的Mc3克隆，由第四军医大学口腔生物学教研室建立。MEC-1细胞来源于一位腭部术后复发的低分化型粘液表皮样癌患者［1］。Mc3克隆来源于MEC-1细胞［2］，在37℃、5%CO2及饱和湿度下培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中。
　　2.药物与试剂：①全反式维甲酸(ATRA)：美国SIGMA公司产品。ATRA以无水乙醇制成10mmol/L的溶液，用0.22μ微孔滤器除菌，置4℃冰箱避光保存。用时以培养液按一定比例稀释。②8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)：天津药物研究院产品，由第四军医大学西京医院杨易灿教授配制成溶液并赠送(10mg/2ml)。常温下保存，用时以培养液按一定比例稀释。③凝集素：为美国Vector公司的生物素化凝集素(表1)。④ABC试剂盒：美国Vector公司。

表1　凝集素的工作浓度和主要特异性糖基
 

凝集素名称	工作浓度	主要特异性糖基
RCA(蓖麻凝集素)	1：1000	D-半乳糖，D-GalANC半乳糖
SBA(大豆凝集素)	1：1000	D-GalANC半乳糖，D-半乳糖
UEA(荆豆凝集素)	1：1000	L-岩藻糖
PNA(花生凝集素)	1：1000	D-半乳糖Gal(1～3)-GalANC

3.培养细胞用品：①RPMI 1640培养基：为美国Gibco公司产品，按说明用三蒸水配制，并加入10%(V/V)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。0.22μ滤器除菌，4℃冰箱保存。②胎牛血清：浙江省金华市清湖犊牛应用研究站出品。③胰蛋白酶(1：250)：进口分装。用无血清培养液配成0.25%的浓度，0.22μ滤器除菌，4℃冰箱保存。④15cm玻璃培养皿：国产。 　　4.主要仪器设备：①CO2恒温孵箱：美国Forma Scientifi公司产。②IMT-2型倒置生物显微镜：日本Olympus公司产。③YJ-875型超净工作台：苏州净化设备厂产。④BH2型普通光学显微镜：日本Olympus公司产。 　　5.方法：取15cm培养皿4个，各放入预处理过的5张载玻片，高温消毒。制备对数生长期Mc3细胞悬液，每张载玻片间隔种4点细胞，共20点，接种后第1天，3个处理组分别加入相应的8-MOP，ATRA，8-MOP+ATRA，使终浓度分别达到43.6μg/ml、30.2nmol/ml、17.2μg/ml+4nmol/ml，以上所加药物的浓度均为30%细胞生长抑制时的浓度［3］。于接种后第6天收集细胞，PBS洗涤，载玻片放入70%乙醇固定，4℃保存备检。用0.75%H2O2-PBS阻断细胞内源性过氧化物酶。然后，加入生物素化凝集素(37℃，30min),PBS洗涤，加ABC复合物(37℃，30min)，PBS洗涤，加3，3—二氨基联苯胺(DAB)底物溶液呈色，系列酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。光镜观察，照像记录。抗体对照采用PBS。 　　6.结果判断和评分方法：凝集素免疫组化染色的阳性信号为黄棕色反应物质，胞膜、胞浆和胞核中均有着色，按着色程度进行评分，分为4级：0级：基本未见着色或着色与背景相似；Ⅰ级：轻度着色，着色浅黄略高于背景；Ⅱ级：中度着色，黄棕色，着色明显高于背景；Ⅲ级：强度着色，深棕色，融合成片。肿瘤细胞均为0级着色的细胞，定为(-)；Ⅰ或Ⅱ级着色的细胞定为(+)；Ⅲ级着色的细胞定为(++)。在装1/2mm测微网400倍视野下，按上述方法计数阳性细胞数和癌细胞总数，共计数200个癌细胞，做χ2检验。 结　　果 　　结果见表2、3。 表2　经8-MOP和ATRA处理后四种凝集素着色情况

责任编辑：姚红祥