摘要　目的:研究羟基磷灰石(HA)、生物玻璃陶瓷(BGC)和钛合金(Ti-6Al-4V)3种骨替代材料的细胞相容性,探讨体外评价骨替代材料细胞相容性的简捷快速的实验方法。方法:选用SD乳鼠颅顶骨成骨细胞,采用体外细胞培养方法,将细胞接种于HA、BGC和Ti-6Al-4V 3种材料表面后,分别观察1、3、5、7 d时细胞形态及生长增殖率,评价3种材料的骨细胞相容性。结果:在3种材料的表面,成骨细胞以锚状结构牢固地粘附,并具有良好的细胞形态和增殖率。其中以HA和BGC的骨细胞相容性较好,Ti-6Al-4V相对较差。结论:体外成骨细胞培养法从细胞形态及生长增殖率方面能客观反映3种硬组织替代材料和细胞之间的相互作用,可作为体外研究骨替代材料细胞相容性的简捷快速的实验方法。

　　成骨细胞作为骨组织的主要功能细胞,承担着骨的修复和改建功能。因而成骨细胞接种在生物材料,尤其是硬组织替代材料表面的形态及功能变化,可客观反映该替代材料的细胞相容性,较之其它细胞如成纤维细胞更灵敏可靠^［1］。体外成骨细胞培养法可从细胞水平、分子水平探讨材料和骨细胞之间的相互作用关系,为综合评价材料的骨细胞相容性提供了有价值的实验模型。由于成骨细胞株在传代中细胞某些生物学特性会迅速减弱,原代分离培养的细胞其生物学特性虽未发生很大变化,但分离培养较为困难,因而迄今为止,国内有关这方面的报道不多。本实验选用体外分离培养的SD乳鼠颅顶骨成骨细胞,将其接种于羟基磷灰石(HA)、生物玻璃陶瓷(BGC)、钛合金(Ti-6Al-4V)材料的表面,观察细胞在材料表面生长及增殖情况,从细胞学的角度综合评价3种材料的骨细胞相容性,为临床使用提供实验依据,同时建立一种简便易行、灵敏可靠的实验方法。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　HA(华西医科大学口腔医学院口腔材料室提供),BGC(华西医科大学口腔生物医学重点实验室提供),Ti-6Al-4V(宝鸡有色金属研究所提供)。

　　1.1.1　圆片型材料制备　HA、BGC材料制备成直径7 mm、厚1 mm的圆片状,Ti-6Al-4V则用金刚砂磨制成直径5 mm、厚1 mm的圆片型。上述材料均用75%乙醇超声震荡清洗后,再换用双蒸水超声震荡清洗数遍,烘干,高压灭菌后备用。

　　1.1.2　材料浸提液的制备　粒度为200目以下的HA、BGC经高温烧结处理,钛粉经多次清洗后烘干。高温灭菌后加入199培养液(日本株式会社提供,含20%小牛血清、青霉素、链霉素、Vit C等)配制成20 mg/ml于37℃静置浸提120 h,4℃保存备用。

　　1.1.3　细胞　选用来源于SD乳鼠的颅顶骨成骨细胞第3代用于实验,同一只乳鼠下颌牙龈成纤维细胞第3代做对照实验^［2］。

　　1.2　方法

　　1.2.1　附着于材料表面的细胞形态学观察　在4只25 ml培养瓶中分别放入HA、BGC、Ti-6Al-4V圆片型材料各4片,将细胞浓度为3×10⁵/ml的鼠成骨细胞分别接种于材料的表面,静置片刻,缓慢从材料边缘加入199培养液,密闭后置于37℃恒温箱中密闭培养。逐日在Nikon倒置相差显微镜(日本)下观察,分别于1、3、5、7 d摄像记录。同时将培养1 d和5 d的材料标本取出,3%戊二醛固定,梯度酒精逐级脱水,CO₂干燥后表面喷金,AMRAY-1000 B扫描电镜(美国)25 kV条件下观察材料表面附着细胞形态。

　　1.2.2　材料浸提液影响细胞增殖的比色法观察　将成骨细胞、成纤维细胞分别接种于96孔培养板中,每一孔细胞量为2×10⁴个。加入199培养液250 μl,于37℃恒温密闭培养24 h,在Nikon倒置相差显微镜下观察细胞已贴壁成活后,分别于每孔中加入材料浸提液100 μl,199培养液150 μl,空白对照组加培养液250 μl。每种材料重复5孔,37℃恒温密闭培养,分别于1、3、5、7 d取样。PBS缓冲液反复清洗,0.05%结晶紫染色20 min,弃去染料,PBS反复清洗后烘干,抽提液(含0.1 mol/L柠檬酸钠6.1 ml、0.1 mol/L HCl 3.9 ml、95%乙醇15 ml)抽提,EL312e酶标仪(美国)比色,波长490 nm,参考波长630 nm,测定每孔光吸收值(OD),取其均值,绘制增殖曲线。

责任编辑：姚红祥