⁶),提取细胞总RNA。取各样品总RNA 2 μg，与等体积RNA稀释液（20×SSC，37％甲醛，体积比3∶2），68℃变性15 min。将样品点样于预先用10×SSC浸泡10 min尼龙膜，80℃烤膜2 h。分别与地高辛标记的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的cDNA探针进行预杂交、杂交、显色及灰度扫描。

　　2　结　　果

　　2.1　传代软骨细胞形态及生长变化

　　在传代过程中软骨细胞形态改变显著，原代细胞多数为圆形或多角形（图1），自第3代开始出现长梭形细胞，到第6代以后长梭形的成纤维细胞样细胞可占90％以上。细胞重叠生长，呈漩涡状，长满单层时细胞数大于原代培养的细胞（图2）。传代软骨细胞生长速度较原代快，细胞倍增时间缩短，通常长满单层的时间为4～6 d(图3)。

图1　原代培养的人髁突软骨细胞多数为多角形或圆形×100

图2　第5代人髁突软骨细胞多数为长梭形×100

图3　不同代的人髁突软骨细胞生长曲线

　　2.2　传代细胞Ⅱ型胶原及蛋白多糖的合成

　　随传代次数增加，Ⅱ型胶原合成逐渐减少。至第7代免疫印迹方法已不能检测出细胞裂解液中Ⅱ型胶原（图4）。甲苯胺蓝染色原代细胞着色深，传代后的细胞染色逐渐变浅，说明软骨细胞合成硫酸软骨素蛋白多糖有减少趋势。

图4　传代人髁突软骨细胞Ⅱ型胶原的免疫印迹

　　2.3　传代软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原mRNA水平的变化

　　采用斑点杂交的方法，检测了不同传代细胞总RNA中pro α₁（Ⅰ）、α₁（Ⅱ）、α₁（Ⅲ）的相对水平。结果表明：pro α₁（Ⅱ) mRNA水平随传代逐渐降低，第7代软骨细胞几乎不能表达pro α₁（Ⅱ）。与之相反pro α₁（Ⅰ）、α₁（Ⅲ）随传代次数增加均有显著增加（图 5，6）。

图5　传代过程中软骨细胞胶原基因表达的变化

图6　传代人髁突软骨细胞前胶原基因表达的变化

　　3　讨　　论

　　软骨来源于未分化的间充质细胞，胚胎时期间充质的中胚层及神经嵴均具有向软骨细胞分化的能力，但只有在特定的条件下，这些细胞才能向软骨细胞分化。目前软骨的分化诱导机制尚不清楚。本研究结果显示出在反复传代过程中髁突软骨细胞由多角形占多数转变为长梭形细胞占优势。并且细胞合成特异性Ⅱ型胶原及蛋白多糖的功能逐渐降低，Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达逐渐升高。形态改变的软骨细胞伴有其表型特征的丧失，这个转化过程与大关节软骨细胞反分化现象是一致的^［4］。

　　反分化是体外培养软骨细胞发生的一种表型特征的丧失。其发生机理及影响因素目前尚不清楚，但研究显示可能与培养环境的变化及传代次数有关^［5］。通常认为只有圆形及多角形的软骨细胞可表达分化的软骨细胞表型，体外反复传代过程中细胞形态发生变化，形状类似于成纤维细胞。这可能因为体外贴壁培养软骨细胞的细胞骨架发生改变，而这种变化可传递到细胞核基质，导致染色质结构的改变，从而影响相应基因的转录^［6］。近来研究表明，许多因素可以调节体外培养软骨细胞的表型特征，如改进培养方法，悬浮或半固体琼脂培养方法^［7］，加入某些因子如BMP₂、IGF-Ⅰ等均能够达到稳定软骨细胞表型、促进其分化的作用。

　　髁突软骨有别于其它关节透明软骨，研究表明髁突软骨细胞能够同时表达Ⅰ型及Ⅱ型胶原。而透明软骨细胞只合成Ⅱ型胶原。因而不能单以出现Ⅰ型胶原的合成作为软骨细胞反分化的标准。应结合Ⅱ型胶原、蛋白多糖合成及细胞形态变化作综合评价^［8］。

　　在骨关节病及软骨损伤异常修复中也可伴有软骨细胞合成胶原类型的改变，并失去合成蛋白多糖基质的功能。因反分化的软骨细胞与之相似，因而可作为骨关节病的体外研究模型，用作探索骨关节病的发病机制，并寻找预防和控制软骨细胞反分化的措施，以治疗骨关节病^［9］。

责任编辑：姚红祥