〔摘要〕　目的：研究维甲酸处理未分化外胚间充质细胞后，细胞增殖和细胞凋亡的变化，探讨细胞增殖、凋亡与维甲酸之间的关系。方法：用5μmol/L维甲酸处理未分化外胚间充质细胞，绘制维甲酸处理前后细胞的生长曲线，并用TUNEL法检测细胞凋亡数量的变化。结果：维甲酸处理未分化外胚间充质细胞后，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡数量显著增加。结论：维甲酸可明显抑制未分化外胚间充质细胞的增殖，这种抑制作用可能是由于启动了细胞凋亡而引发的。
关键词　维甲酸;凋亡;干细胞

　　如果在鼠胚面突发育的早期给予维甲酸(retinoic acid,RA)，则会诱导胚鼠形成面部畸形，如唇裂、腭裂等［1］。在腭裂形成的实验中，我们已观察到RA处理妊娠12d的孕鼠后，胎鼠的腭突细胞生长受到抑制，所形成的腭突体积比正常的小，以致两侧的腭突不能发生融合，形成腭裂［2］。究竟是何种原因引起细胞生长抑制呢？
　　维生素A代谢产物RA在胚胎发育、细胞分化和成熟过程中均有重要的作用，现已发现RA胞内核受体(RAR和RXR)和相应配体RA结合后，可与靶基因特定的DNA序列结合，在AF-1和AF-2协同下激活靶基因mRNA转录，发挥其治疗作用［3］。全反式维甲酸诱导分化急性早幼粒细胞白血病(ALP)过程中，肿瘤细胞出现凋亡。
　　RA对细胞凋亡的诱导作用大多是从肿瘤细胞的研究中得出的，RA对于正常发育的胚胎细胞有没有这种作用呢？RA对正常的胚胎细胞的增殖抑制原因是什么还不清楚。为了明确RA对未分化间充质细胞增殖与凋亡的影响，我们用RA处理未分化外胚间充质细胞，并对处理前后细胞的增殖与凋亡进行了研究。

1　材料方法

1.1未分化外胚间充质细胞的培养及RA诱导
　　将妊娠12d的孕鼠脱颈处死，取胎鼠面突，2.5g/L胰酶消化上皮，分离上皮于间充质，用组织块法对上皮层下的外胚间充质细胞进行原代培养，培养液为DMEM培养基（低糖）(GIBCO,1kg/L)，补加200ml/L胎牛血清，106U/LLIF(白细胞分化抑制剂Esgro)，加适量青霉素和链霉素，使二者终浓度均为105U/L。传至第5代时用于实验。每次将RA现加入培养液中，终浓度分别为5μmol/L，对照组中加入等量的无水乙醇溶剂。每48h换1次培养液(内含等量的RA或无水乙醇)。
1.2RA处理未分化外胚间充质细胞后生长曲线的绘制
　　收集对数生长期细胞，并调整细胞浓度，接种于24孔培养板(细胞数3×104个/孔)，每次收集RA处理组和对照组各3孔，计数后取平均值，绘制细胞生长曲线，比较两组细胞的倍增时间。
1.3TUNEL法检测RA处理后的细胞凋亡
　　用细胞离心机分别收集处理组和对照组的细胞，TUNEL法见参考文献［4］。
1.4统计分析
　　RA处理组和对照组分别选取3个不同的视野，计算阳性细胞的百分数，然后进行χ2检验。

2　结　果

2.1RA处理后未分化外胚间充质细胞生长曲线的变化
　　图1显示RA处理后，未分化外胚间充质细胞生长受到抑制，其抑制作用始于处理后2d。计算两组的倍增时间可得知，正常组的倍增时间为29.04h，而RA处理组为47.34h。

图1　RA处理未分化外胚间充质细胞后生长曲线的变化

2.2RA处理后未分化外胚间充质细胞后细胞凋亡数量的变化
　　阳性信号为紫蓝色颗粒，主要位于胞核内。RA处理未分化外胚间充质细胞后，胞核阳性的细胞凋亡数量明显增加(图2、3)。正常组阳性细胞数占4.76%，而RA处理组则上升至39.18%。χ2检验结果，2组之间有显著性差异(P<0.01)。

图2正常的未分化间充质细胞中，图3RA处理后，阳性细胞数
　　　阳性细胞数目较少。TUNEL×200　　目显著增多。TUNEL×200　　　

3　讨　论

　　机体内细胞数目是细胞增殖和细胞死亡动态平衡的结果。细胞死亡可分为细胞坏死和细胞凋亡两种。凋亡对后生动物门动物的发育、自身稳定起中心作用，是细胞数目精细调节的一个主要机理，可清除不需要的、已严重受损的、有潜在危险性的细胞［4］。但目前越来越多的研究表明，凋亡除了在肿瘤发生中起作用外，在胚胎的正常发育中也发现有凋亡细胞的存在，从而提示了凋亡在生物体内作用的广泛性。

责任编辑：姚红祥