〔摘要〕　目的：探讨腭裂形成过程中腭突间充质细胞的增殖周期的变化及其调节基因P21cipl/wafl基因表达的意义。方法：用原位杂交、TUNEL染色检测两组小鼠腭突间充质细胞增殖周期调控基因P21cipl/wafl基因的表达及细胞程序性死亡的发生。结果：在腭突发育的垂直生长期、上抬期，实验组中TUNEL阳性指数明显高于对照组（P<0.01)。同时，P21cipl/wafl基因mRNA的转录水平也比同期对照组腭突间质细胞中P21cipl/wafl基因的表达增高（P<0.05）。结论：在腭突发育时期，实验组小鼠腭突间充质未分化细胞增殖周期抑制。P21cipl/wafl基因表达升高提示可能参与了细胞增殖周期抑制过程。
关键词　腭裂；细胞周期；P21cipl/wafl基因;程序性细胞死亡

　　胚胎时期细胞的增殖多于细胞死亡，机体处于一个生大于死的动态平衡中，发育的个体才得已迅速成长。因此，胚胎早期，细胞的增殖及其增殖周期的调控是否正常对胚胎的发育尤其重要。近年来的研究发现众多的细胞周期负调控基因表达在细胞周期时相的变迁中起重要调节［1］。本研究采用维甲酸诱导建立的C57BL/6N近交系小鼠腭裂模型，用原位杂交方法检测了细胞周期蛋白激酶抑制物基因P21cipl/wafi基因在小鼠腭突正常发育及腭裂形成过程中的表达变化，以期了解P21cipl/wafl基因对胚胎时期腭突间充质细胞增殖周期的调控作用。

1　材料和方法

1.1实验动物及标本制备　将妊娠10d孕鼠随机分为实验组和对照组。按小鼠体重计算给药剂量，实验组小鼠管饲全反式维甲酸80mg/kg(上海第六制药厂)，溶于0.2ml植物油中。对照组管饲等体积的植物油。分布于妊娠第13d14h（略写为GD1314以下类同）、GD1322、GD148、GD1414、GD1422、GD158、GD15227个时间点脱颈处死孕鼠各1只，GD168处死孕鼠各3只，剖宫取胚鼠。体积分数为10％中性甲醛固定2h，常规组织处理后，仔细切除躯干部，小鼠喙部朝下，常规石蜡包埋。5μm连续切片，68℃烤箱烘干。168的标本切片先做HE染色。
1.2TUNEL染色方法　见文献［2］。
1.3原位杂交染色方法　见文献［3］。
1.4TUNEL阳性细胞及P21阳性表达细胞指数　TUNEL阳性信号为细胞核蓝色着色。P21原位杂交阳性信号为胞浆的蓝色颗粒。按腭突垂直生长期(GD1314～GD148)、上抬期(GD1414～GD158)、融合期(GD1522～GD168)，用网格（10×10〕测试法，每例计数4个高倍镜视野（40×〕腭突中间充质细胞总数以及阳性细胞数，每个时间点选2例标本。由此，可获得TUNEL及P21基因阳性细胞指数TI、PI。
TI＝TUNEL阳性细胞数/（阴性细胞＋阳性细胞)×100％。
PI＝P21基因阳性细胞数/（阴性细胞＋阳性细胞)×100％。
1.5统计学分析　χ2　检验。

2　结　果

2.1腭裂模型的建立　实验组、对照组分别获胚鼠61只、69只。对照组GD168的20个标本中，HE染色结果观察，两侧腭突之间已经牢固结合。而实验组GD168的17个标本中两侧腭突之间均未互相融合，口腔、鼻腔仍相通。2.2阳性细胞率的比较　按腭突垂直生长期,上抬期,接触融合期分别观察，并对每个发育时期中的两组阳性细胞指数进行比较分析。PCD阳性细胞计数及分布观察：腭突发育至垂直生长期和水平上抬期实验组中阳性细胞数量明显多于对照组（P<0.01)（图1、2）。在垂直生长期阳性细胞集中于腭突的顶端，至上抬期水平向腭突的下1/3处见散在的阳性细胞分布。至接触融合期两组中PCD阳性细胞数量无明显差异（P>0.05)。P21阳性细胞数量及分布观察：在腭突垂直生长期及上抬期，实验组腭间充质中P21mRNA的转录水平明显高于对照组（P<0.01)，阳性细胞多见于腭突顶端边缘（图3、4）。腭突发育至接触融合期，实验组中P21基因表达水平也高于对照组（P<0.05)，阳性细胞散在分布于腭突间质中。如表1所示。

图1　实验组GD1322，腭突垂直生长、PCD阳性细胞多并集中于腭突顶端及边缘

责任编辑：姚红祥