摘要　目的:明确程序性细胞死亡在腭裂形成中的作用。进一步探讨调控程序性细胞死亡的相关基因在腭裂形成中的变化及分子生物学机制。方法:将16只妊娠10 d(GD10)的C57BL／6N系小鼠随机分为实验组和对照组。实验组管饲维甲酸80 mg／kg,对照组管饲等体积植物油。分别于GD1314(妊娠第13天第14小时,下同),GD1322,GD148,GD1414,GD1422,GD158,GD1522,GD168 d处死孕鼠取胚鼠。胚鼠头部切片做原位末端转移酶标记（TUNEL)染色。结果:在腭突垂直生长期及定向移动期，两组腭间质细胞发生程序性死亡的数量有明显的差异（P<0.05）。结论:经外源性维甲酸作用后的小鼠腭突间质细胞发生大量程序性死亡，腭突体积发育瘦小，未能在中线相互融合而导致腭裂。

　　关键词　程序性死亡　腭裂　腭突　维甲酸　原位末端转移酶标记

　　程序性细胞死亡（ program cell death，PCD）又称细胞凋亡（apoptosis），在保障机体正常发育、维持机体内环境的稳定［1］中发挥着重要作用。在腭裂发生机制的深入研究中，建立了各种动物的腭裂模型。其中致畸率最高、腭裂发生最稳定的是维甲酸诱导的C57BL／6近交小鼠［2］，但国内尚见到这种小鼠腭裂模型的研究报道。本研究利用维甲酸诱导建立C57BL／6N系小鼠腭裂模型，并用原位末端转移酶标记（TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL）方法，探讨程序性细胞死亡在腭突发育过程中的作用及对腭裂形成的影响。

1　材料和方法

1.1　实验动物及标本制备
　　12周龄，体重25 g以上的C57BL／6N系小鼠。雌、雄比例为2∶1，前一天晚8点同笼。次日晨观察雌鼠阴栓情况，有阴栓者为妊娠0天（gestation day 0，GD 0），隔离饲养。妊娠10 d下午1时，将20只孕鼠随机分为实验组和对照组。实验组管饲全反式维甲酸（上海第六制药厂），剂量80 mg/kg（溶于植物油中）。对照组管饲等体积植物油。分别于GD1314(妊娠第13天第14小时,下同),GD1322,GD148,GD1414,GD1422,GD158,GD1522,7个时间点脱颈处死实验组及对照组小鼠各1只。为明确实验组腭裂发生率,GD168处死小鼠各3只。剖腹取胚鼠，两组获胚鼠分别为61和69只。10％中性甲醛固定。脱水后头部喙部朝下，石蜡包埋。5 μm切片，烤干。
1.2　TUNEL法标记PCD细胞
　　TUNEL法（试剂盒购自美国Oncor公司）。切片常规脱蜡，至蒸馏水，蛋白酶K 20 μg／ml室温下消化15 min。含3％双氧水的PBS溶液中5 min。加50 μl平衡液（ TUNEL试剂盒)1 min。加含TDT酶反应液的混合物10 μl（TUNEL试剂盒）,37 ℃下孵育1.5 h。标本置入预热的中止反应液（TUNEL试剂盒），37 ℃下30 min,缓冲液1(0.1 mol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl）中漂洗15 min 2次。2％正常羊血清，37 ℃孵育30 min。加抗地高辛碱性磷酸酶抗体，湿盒中37 ℃下孵育2 h。缓冲液1,缓冲液3(0.1 mol/LTris-HCl,0.1 mol/L NaCl, 0.05 mol/L MgCl2)中分别振荡漂洗，加新鲜配制的显色液(NBT/BCIP显色系统）20 μl，暗处过夜。中止显色后，胞浆用伊红衬染，梯度酒精脱水。二甲苯透明后封片。
1.3　PCD细胞的计数
　　阳性信号为覆盖整个细胞核的深蓝色着色。选相同时间点的实验组及对照组的标本，每例选择5个高倍镜视野，用网格测试法按公式计算PCD阳性指数：
　　PCD阳性指数=ΣPCD阳性细胞数／Σ高倍镜视野内细胞总数×100％
1.4　统计学方法
　　χ2检验。

2　结　　果

2.1　腭裂发生率
　　从HE染色看，对照组168 C57BL／6N系小鼠20个标本中，两侧腭突之间已经牢固结合。而实验组相同时间点的17个标本中两侧腭突之间均未互相融合，口腔、鼻腔仍相通。
2.2　阳性细胞率的比较
　　按腭突垂直生长期（GD1314～ GD148），上抬期（GD1414～GD158），接触融合期（GD1522～GD168）分别观察，计数PCD阳性细胞并对每个发育时期中的实验组、对照组阳性细胞标示率进行比较分析。对照组腭突垂直期PCD阳性细胞较少并散在于腭突间质中（图1），腭突发育至上抬期及融合期PCD阳性细胞逐渐集中于腭突的边缘（图2）；实验组腭突垂直期及上抬期中PCD阳性细胞分布于整个腭突中，数量明显多于对照组（图3，P<0.05），腭突发育至接触融合期，PCD阳性细胞数量减少（图4），与对照组相比无明显差异（P>0.05）(表1)。

责任编辑：姚红祥