［摘要］　目的　本研究旨在评价组织工程技术修复皮肤缺损的可行性。方法　采用Yorkshire猪，在其背部脊柱两侧做6个直径4cm的圆形全厚皮肤缺损，随机分为3组。第1组为空白对照；第2组仅置无细胞的pluronic；第3组分别用角朊细胞-pluronic、成纤维细胞-pluronic复合物置于创面上。第4、6周时取材，进行大体、组织学和透射电镜观察。结果　4-6周时表皮和真皮间界面明显被上皮嵴和真皮乳头所分隔。对照组无皮肤形成，仅被新生炎性肉芽组织所替代。组织工程化皮肤边缘收缩，组织学显示与正常皮肤相似，可见表皮分层及其下较厚的真皮。透射电镜可见，基板发育良好，并与基质紧密相连。结论　以pluronic F-127为载体形成的组织工程化皮肤可作为一种新型皮肤替代物修复全厚皮肤缺损。
［关键词］　组织工程;皮肤;Pluronic F-127;表皮;真皮

　　自Rheinwald与Green体外大规模培养角朊细胞获得成功以来，体外重建表皮取得了很大进步［1］。但临床实践发现，培养的表皮组织因缺乏真皮成分，存在以下缺点：创面愈合后瘢痕增生严重，抗感染能力差，不耐磨，弹性欠佳等。随着有效促进角朊细胞分化增殖药物的应用，其培养技术虽得到改进，但临床应用效果仍不甚理想。
　　皮肤缺损修复常用方法有4种：自体皮肤移植、同种异体皮肤移植、异种皮肤移植和人工皮肤移植。自体皮肤移植虽然不存在免疫排异反应，但皮肤的来源有限，且必须以牺牲人体部分正常组织为代价。同种异体和异种皮肤移植因组织相容性不理想，会因免疫排异反应而告失败。人工皮肤近年来虽然应用较为广泛，但仍然存在异物反应和感染等风险。因此，皮肤替代物的局限性仍制约着其临床应用［2］。组织工程的提出与发展，使应用这一新技术在天然或生物合成材料上接种皮肤细胞进行种植成为可能。在生物支架逐步降解吸收的过程中，种植的细胞继续增生繁殖，形成新的组织工程化皮肤，达到修复创伤和重建自身组织功能的目的。本研究旨在探讨应用组织工程技术修复皮肤缺损的可行性。

1　材料与方法

1．1　制备Pluronic F-127
　　方法参见文献［3］，制备25% Pluronic F-127（BASF Mount Olive）凝胶。Pluronic F-127是一种氧化异丙烯，低于4℃时，呈液态；高于15℃时，转为固态，是制备皮肤组织的理想材料。
1．2　分离角朊细胞和成纤维细胞
　　取3只4-6周龄，重16-18kg Yorkshire猪，常规消毒、麻醉，取脊柱旁全厚皮肤标本，0.25%EDTA(Sigma，USA)冲洗，剪成2cm宽小条，0.25%胰蛋白酶（Sigma，USA)37℃消化1h。之后，分离表皮和真皮，剪成小块，用等量0.15%Ⅰ型胶原酶（Worthington Biochemical Corp）和0.25%胰蛋白酶37℃消化6-8h。
1．3　角朊细胞和成纤维细胞培养
　　消化好的表皮、真皮，经过滤、离心，制成单细胞悬液，表皮细胞用角化细胞培养液（Sigma，USA）（内含谷氨酰胺292mg/ml、维生素C 50μg/L、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、表皮生长因子10ng/ml、胰岛素5μg/ml、转铁蛋白5μg/ml等），成纤维细胞用含10%胎牛血清的DMEM（Gibco,USA）培养液，置37℃、5%CO2培养箱培养。用175 cm2培养瓶，细胞接种密度为1.7×104/cm2，3-4d换液1次。7-10d，相差显微镜下见汇合的多层角朊细胞和单层成纤维细胞（图1A、B）。此时，0.05%胰蛋白酶-EDTA消化、细胞传代，体外传代2-3次，细胞计数及活性测定。

　图1A　体外培养的单层成纤维细胞(相差显微镜×20)
Fig.1A　 Monolayer fibroblast in vitro under phase-contrast microscopy(×20)

图1B　体外培养的多层角阮细胞 (相差显微镜×20)
Fig. 1B, Multilayer keratinocyte in vitro under phase-
contrast microscopy (×40)

1．4　制备角朊细胞、成纤维细胞- pluronic F-127复合物
　　25% pluronic F-127经0.22μm滤膜过滤除菌，2.5ml pluronic与角朊细胞混匀（细胞浓度为2.0×107cells/ml），3.5ml pluronic与成纤维细胞混匀(细胞浓度为2.5×107cells/ml)，4℃保存备用。

责任编辑：姚红祥