2.2　TUNEL法染色结果

　　阳性细胞细胞核呈紫蓝色,凋亡细胞主要分布于软骨增殖带及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域(图1,2),深层肥厚层的成熟软骨细胞多呈空泡样,TUNEL法不易着色;E14～E15 d关节腔开始形成时软骨表面凋亡细胞多(图3);出生后凋亡细胞也主要分布于软骨增殖带及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域,凋亡软骨细胞于关节的功能部位(髁状突前斜面、关节结节前斜面)更明显。

 胎鼠 (E19)髁状突增殖层软骨细胞PCD×200

　　2.3　bcl-2 mRNA原位杂交

　　bcl-2阳性反应可出现于细胞浆或细胞核,bcl-2表达阳性细胞呈紫蓝色,出生前、后的关节髁状突软骨增殖层、浅肥厚层软骨细胞均有明显的表达,而进入深层肥厚层仅有极少数bcl-2阳性表达的成熟软骨细胞散在分布。

　　3　讨　　论

　　细胞凋亡亦称程序化细胞死亡(programmed cell death, PCD),是在基因控制下的一种细胞自我消亡形式。它在胚胎发生、器官发育、变态反应、肿瘤发生及保持机体的稳态中发挥着至关重要的作用^［2］。骨和关节的发育是一个复杂的过程,其间伴随着PCD及其调控基因的表达和信号分子的传导,PCD的紊乱可能导致骨和关节的畸形^［3,4］。TMJ是结构及功能均复杂的关节,其发育过程中PCD的异常可能导致TMJ先天性畸形、左右关节不对称等,由此可成为TMD及颞颌关节骨关节疾病(TMJOA)的病因^［5,6］。

　　TUNEL法染色显示在TMJ的发育中(出生前及生后1周),下颌髁状突软骨中均有规律性分布的PCD,PCD阳性细胞主要位于髁状突软骨的增殖带及浅层肥厚层与深层肥厚层交界的区域。此结果与Matsuda等^［4］用透射电镜观察到仅于P1 d出现髁状突软骨细胞PCD不同。一般认为,增殖带是由未分化的间充质细胞构成的,它具有不断增殖、分化为软骨细胞的能力,该区出现的PCD可能与增殖带细胞的增殖分化有关,机体通过PCD控制软骨细胞的数量达到控制生长速度的目的。Roach等^［7］通过鸡股骨生长板的培养研究,发现软骨生长板肥厚层软骨细胞向骨端移动的过程中逐渐凋亡,证实了软骨成骨中凋亡是软骨细胞的主要消亡形式。而本实验中的PCD出现于浅层肥厚层与深层肥厚层交界区域,推测可能与软骨细胞的成熟相关,作为继发性软骨的髁状突软骨虽然具有软骨生长板样的生长功能;但与原发性生长板软骨不同。E14～E15 d关节腔开始形成时软骨表面PCD显著,表明关节腔的形成与PCD有关,关节腔可能是临近关节腔面的细胞PCD后出现的。出生后由于吮乳、咀嚼及发音等功能的需要,下颌运动频繁,使下颌髁状突软骨功能受力,软骨细胞功能活跃,PCD也明显。作者认为可能与软骨组织塑形、改建有关。

　　bcl-2是1984年由Tsujimoto等^［8］从14号与18号染色体易位的滤泡性淋巴瘤中分离出的一种原癌基因。bcl-2基因可以编码两个结构相近的BCL-2α(26 kD)和BCL-2β(21 kD)蛋白,该蛋白属于跨膜蛋白,主要分布于核膜、线立体膜及内质网膜上。已知bcl-2可控制核内外物质的运输及抑制Ca²⁺的释放或阻断细胞内过氧化物的堆积而抑制细胞的凋亡。Amling等^［9］用免疫组化证实在整个长骨软骨生长板都有bcl-2基因的表达,而且以深层增殖层软骨细胞及浅层肥厚层软骨细胞表达水平高,深层肥厚层细胞表达水平低。Amling等^［9］进一步在剔除bcl-2基因的小鼠中发现软骨生长板明显变薄,其主要原因是增殖层细胞减少,剔除bcl-2的小鼠可加速软骨细胞的分化,使软骨细胞成熟加快导致整个骨骼变短。说明bcl-2调节软骨生长板肥厚层软骨细胞的凋亡是正常骨骼发育及软骨骨化所必需的。bcl-2在髁状突软骨的表达与长骨生长板相似,表明bcl-2也参与了髁状突软骨细胞的增殖、分化、成熟过程。在Amling等的实验中还发现甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)的表达分布与bcl-2一致。Lee等^［10］进一步发现PTHrP基因阴性的动物生长板肥厚层软骨细胞PCD及bcl-2表达减少;PTHrP基因阳性的动物生长板肥厚层软骨细胞PCD及bcl-2表达明显,显示bcl-2可能是PTHrP下游的发挥抑制软骨细胞分化的基因。由此可见bcl-2也可通过抑制软骨细胞分化及调控PCD的数量,达到控制髁状突软骨的生长及关节发育的作用,髁状突软骨肥厚层中也有少数细胞bcl-2表达阳性,说明此部分细胞具有增殖、分化的能力,它们可能是软骨肥厚层中不凋亡的细胞,与Roach等

责任编辑：姚红祥