摘　要：目的：研究体外分离培养的兔骨骼肌卫星细胞(SC)的生物学特性。方法：采用细胞培养方法，对兔骨骼肌SC进行活细胞观察，并测定兔骨骼肌SC的细胞生长曲线、细胞分裂指数、细胞贴壁率。结果：①兔骨骼肌SC为梭形，呈长轴平行排列，具有明显的方向性；②体外培养的兔骨骼肌SC在10代以内生长稳定，超过10代以后肌SC的融合能力和形成肌管的能力也随之下降。结论：体外培养的兔骨骼肌SC在合适的传代比例和培养条件下在体外能够生存并保持其特性。从肌SC稳定的生物学特性看，可以将其作为研究肌肉受损后再生修复的细胞模型，用于检测和研究某些基因和生长因子对肌肉再生和功能恢复的影响。

　　肌卫星细胞(SC)是一种正常情况下位于成熟肌纤维表面的肌源性细胞。当肌纤维损伤或受到一定刺激后，即促使原来广泛分布的SC向受损区迁移并被激活，进行有丝分裂，随后SC之间相互融合或与受损肌纤维末端融合，融合后的细胞即开始合成收缩蛋白。通过这种方式恢复受损肌肉的连续性和收缩功能^〔1〕。体外培养的兔骨骼肌SC与体内的SC相比，其生物学特性如何，发生了那些变化，将直接影响到利用SC进行进一步的研究，目前相关的研究报道很少。本实验的目的在于对体外分离培养的兔骨骼肌SC的生物学特性进行研究，并比较组织块法、改良酶消化法和密度梯度离心法3种方法获得的兔骨骼肌SC的活细胞形态和生长特性。

　　1　材料和方法

　　1.1　实验动物为两月龄新西兰白兔。

　　1.2　采用组织块法、改良酶消化法和密度梯度离心法^〔2〕分离兔比目鱼肌的SC，进行培养。对三种方法所获SC利用倒置显微镜进行活细胞形态观察；采用MTT法测定SC的生长曲线；同时测定SC的分裂指数和细胞贴壁率。

　　2　结　果

　　2.1　原代或传代后的肌SC倒置显微镜下的观察

　　2.1.1　组织块法　兔骨骼肌SC原代培养后第3天，在组织块周围长出梭形细胞和星形细胞，细胞体积中等，散在分布，细胞间较少见紧密连接(图1)。第9～10天，培养瓶中细胞长满。从第7天开始，梭形细胞的排列开始出现方向性，它们的长轴平行排列，部分细胞之间开始出现融合，形成多核细胞，同时有肌管形成。星形细胞呈网状排列。传代后的细胞部分呈梭形，多呈方向性排列；部分呈星形。融合的梭形细胞数量明显增加(3～6个/20×10倍视野)。根据免疫组化染色鉴定的结果，可确定该细胞是肌SC，但随传代次数的增加，星形细胞数量迅速增加，其生长速度远远快于梭形细胞。这样，在一定的生长时间内，梭形细胞数量相对逐渐减少。

　　2.1.2　改良酶消化法　原代培养24 h后即开始有细胞贴壁，多为梭形细胞，经鉴定是肌SC，呈长轴平行排列，少数为星形细胞。第3天部分肌SC即开始出现融合，肌管结构形成现象多见。传代后观察同组织块法。

　　2.1.3　密度梯度离心法　将细胞悬液加入15 ml离心管中，其下方为11.5 ml 20% Percoll，最底层为60% Percoll 1.5 ml。然后进行离心。根据密度指示球可划分为7层。各层容积分别为1～4层各2.5 ml，5、6、7层分别为2.1、0.5、1.4 ml(图2)。取第6、7层细胞进行培养，在原代培养24 h后即开始有细胞贴壁，几乎全部是梭形细胞，呈长轴平行排列，星形细胞和圆形细胞(红细胞)极为少见。从第3天开始出现梭形细胞融合成多核细胞和肌管形成现象。传代后几乎全部为梭形细胞，梭形细胞融合成多核细胞以及肌管形成现象多见(图3)。

图1　组织块法获得的细胞，第3 天(20×)

图2　密度梯度离心法各层细胞分布

　　图3　密度梯度离心法获得的细胞，可见梭形细胞融合，肌管形成(20×，HE染色)。

　　2.2　兔骨骼肌SC的生长曲线

　　从图4中可以看出，细胞在接种培养后第2天数量有所减少，属于生长适应期。第3 天细胞数量重新开始增加。第4～6天细胞增殖速度最快，到第7 天增殖速度逐渐减慢。

责任编辑：姚红祥