1.5.4　钙染色：将传代的培养细胞(第2代)接种培养28～35天，细胞呈复层生长并出现圆形或卵圆形结节，取出盖玻片，用37°C生理盐水漂洗数次，经10%中性缓冲福尔马林固定30min，作Von Kossa钙染色。
1.5.5　超薄切片透射电镜观察：将传代培养4天的细胞(第2代)，用0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，以800r/min×5min，低速离心收集细胞，经2.5%戊二醛液固定后，按常规透射电镜制片方法制成超薄切片，在TEM(H-500，HITACHI)下观察其超微结构。
1.5.6　扫描电镜观察：将传代细胞(第2代)培养4天后，取出长满细胞的盖玻片，用37°C生理盐水漂洗2次后，经2.5%戊二醛液固定，按常规扫描电镜制片方法制成扫描电镜样本，在SEM(JSM-T300，JAPAN)下观察细胞形态。骨髓基质细胞经18～20天左右培养，细胞呈复层样生长，形成细胞结节

2　结果
2.1　倒置显微镜下细胞生长、形态的观察
　　原代细胞接种后48h，细胞出现纺锤形改变，即开始贴壁生长，随着培养时间延长，贴壁细胞明显增多，并分裂增殖。7～10天细胞呈多种形态外观：星形，三角形，多角形，长梭形等，胞体膨大，伸出长短不一，粗细不均的多种形态胞浆突起，胞核大，核仁1～2个，位于胞体一侧，细胞呈团簇状生长，分布不均，显示出集落生长趋势。中心细胞轮廓不清，体积变小，而周边细胞形态不变，至14天左右，细胞融合成单层。不作连续传代培养的细胞，集落成团中心细胞互相重叠形成复层，约30天后，中心细胞发生钙化，形成肉眼可见的散在白色点状物，集落外周细胞交错排列成网状(见图1)。传代细胞经0.25%胰蛋白酶消化后变形，呈圆形，经24h后恢复原来形态，并贴壁增殖，形态和原代细胞相似，4～5天后融合形成单层细胞。连续培养传了9代，均生长良好，后因细菌污染未能进一步观察。

图1　骨髓基质细胞原代培养H-E染色(×100)

2.2　HE染色
　　光镜下所见，细胞形态为长梭形，三角形，多角形等，有多个树状突起，胞核圆形，呈浅兰色，胞浆呈细网状，并见较多胞浆颗粒。
2.3　ALP染色
　　细胞经染色后，胞浆的ALP显示为灰色，棕色，黑色沉淀，即为阳性。随着传代增加培养细胞ALP阳性率逐渐增高。均在75%以上。
2.4　钙染色
　　细胞经30天培养，Von Kossa染色后，可见黑色沉着物沿着胶原纤维走向分布，细胞间连接处亦见大量黑色沉着物，即Von Kossa染色阳性。
2.5　超薄切片TEM
　　细胞有较多粗细长短不一的胞浆突起，胞体内胞浆丰富，有大量核糖体、线粒体，高尔基体及粗面内质网，有丰富的颗粒状电子致密物，胞核大，不规则，有1～2核仁，可见核突或核袋，染色质丰富，呈团簇样分布。
2.6　扫描电镜SEM
　　细胞呈多种形态，如三角形、鳞片形，星形，有较多的突起，相互连接，细胞互相重叠，呈多层样结构。(见图2)

图2　骨髓基质细胞传代培养扫描电镜观察(×200)细胞呈复层生长，互相重叠，呈多种生长形态，如三角形、多角形、星形等，并有较多的细胞突起且互相连接

3　讨论
3.1　骨髓基质细胞及其培养成骨潜能
　　骨髓依其功能分为造血和基质系统。骨髓基质是指骨髓腔内为造血系统提供结构及功能支持的结缔组织，其成骨潜能来源于基质系统的基质细胞。Friedenstein等将鼠骨髓细胞上培养24h即见基质细胞贴附于管壁，3～4天后，形成数个成纤维样细胞组成的集落。这种集落是由单个细胞稳定地增生而来的，是克隆性的。随着培养时间延长，集落细胞增殖扩大，逐渐融合成层。大量的实验表明：体外培养骨髓基质细胞，可以稳定地形成成纤维样细胞组成的细胞集落，Friedenstein把形成集落的初始骨髓基质细胞称为成纤维样细胞集落形成单位(或细胞)(colony-forming unitfirbroblastie, CFU-F)。而且表明CFU-F是由基质干细胞和混合祖细胞组成，具有多种分化潜能，能进一步分化为成骨细胞系、成纤维细胞系、成脂肪细胞系［2］。同时CFU-F形成的细胞集落在大小、形态和酶活性等方面存在明显的差别，表明骨髓基质细胞CFU-F是多相细胞群体。Friedenstein等将获得的集落细胞移入微孔滤膜扩散室(millipore diffustion chamber, MDC)植入体内继续培养，观察到在扩散室内基质细胞进行了成骨活动，其成骨过程类似膜内成骨，即基质干细胞和骨祖细胞直接分化为成骨细胞并合成、分泌骨胶原，成骨细胞被埋于钙化骨胶原中而成为骨细胞。由于微孔膜滤扩散室的孔隙仅为0.45μm，只允许小分子的营养物、代谢物的自由出入，而周围组织细胞无法长入，因此证明扩散室内形成的骨组织是由骨髓基质细胞所为，而且没有骨吸收现象，表明MDC中的细胞是纯成骨性的。国内李世勇(1994年)的研究也证实这点［3］。Mamiatopoulos等［4］(1988年)首次报道鼠骨髓基质细胞在体外培养能形成钙化的骨样组织，经X线衍射分析确定形成的钙化物具有羟基磷灰石结构，证明体外培养骨髓基质具有成骨能力。Benayahu等［5］将骨髓基质细胞体外培养获得具有典型的成骨细胞特性的细胞：具有较高的ALP活性，只产生Ⅰ型胶原，受PTH刺激则细胞内CAMP增加，在条件培养液中可以产生矿化的细胞外基质(Von Kossa，染色阳性)，并且装入MDC中体内培养可形成骨。Gimble等［6］在体外将骨髓基质细胞培养成功地转化为成骨细胞。现已证实：骨祖细胞有两种类型，一种为诱导性骨祖细胞(inducible osteogemic precursor cell, IOPC),是一种未分化的间叶细胞，存在于所有的结缔组织中，它们不能自发地形成骨组织，在骨形态发生蛋白(BMP)等诱导因子作用下可转化为成骨细胞系，产生异位骨质，但若诱导因素一旦去除，新形成的异位骨组织就会被吸收掉。另一种为定向性骨祖细胞(determined osteogenic precursor cell, DOPC)仅在骨髓基质、骨膜生发层及骺板软骨基质中发现，可自动向成骨细胞系转化，并有合成骨基质的能力。骨髓是唯一含有丰富的诱导性和定向性骨祖细胞的组织，且骨髓间叶细胞诱导成骨活性最强，骨髓中骨形成细胞即骨祖细胞属基质性，而且能和造血细胞分离开来，并在体外培养而获得，可转化为成骨细胞。因而用骨髓基质细胞为材料进行体外培养来建立成骨细胞体外培养模型是合乎逻辑的。本实验，用骨髓抽取物经淋巴分离液提取骨髓基质细胞进行体外培养，基质细胞在培养液中呈贴壁生长，经换液或传代，无粘附性杂细胞被清除，基质细胞得以纯化而继续培养。

责任编辑：姚红祥