2　结　果

2.1 HE染色　E13 d颞下颌关节区开始出现未分化间充质细胞聚集、增殖、分化为软骨细胞，至E14 d颞下颌关节髁状突软骨组织增厚，软骨各层分界明显；E 14～E 15 d关节腔开始形成，E 17、18 d关节盘出现；E13 d即可见下颌骨体部端有骨化出现，以后骨化逐渐扩展到髁状突颈部；出生后关节软骨逐渐变薄，下颌骨骨化接近关节软骨区。
2.2 PCNA 免疫组织化学染色　PCNA 阳性细胞为胞核着棕黄色。胚胎颞下颌关节髁状突软骨增殖层PCNA 阳性软骨细胞多（图1），进入浅层肥厚层PCNA 阳性软骨细胞数逐渐减少（图2），深层肥厚层中未见PCNA 阳性软骨细胞。出生后髁状突软骨增殖层及浅肥厚层PCNA 阳性细胞率均较出生前低。PCNA 阳性细胞率详见表 1。

图1　E14 d，髁状突软骨增殖层PCNA 表达阳性软骨细胞多（40×15）

图2　E14 d，髁状突软骨浅层肥厚层PCNA 阳性细胞数减少（40×15）

表1　出生前、后增殖层及浅肥厚层中 PCNA、PCD 阳性细胞率　　( %，±s)

分组	PCNA	PCD
生　增殖层	55.3±3.9	19.0±3.2
前　浅肥厚层	11.9±2.8	15.4±2.6
生　增殖层	34.2±3.1	18.5±3.6
后　浅肥厚层	8.0±2.2	14.2±2.8

2.3 TUNEL染色　阳性细胞为细胞核着紫蓝色，出生前、后 PCD阳性细胞主要分布于软骨增殖层及邻近深层肥厚层的浅层肥厚层中（图3，4），深层肥厚层成熟软骨细胞中PCD 阳性细胞少；仅于邻近骨化端处散在出现PCD 阳性细胞，E 14～E 15 d关节腔开始形成时软骨表面PCD 阳性细胞多。PCD 阳性细胞率详见表1。

图3　E19 d， 髁状突软骨增殖层中PCD 阳性细胞（40×15）

图4　E19 d，髁状突软骨浅层肥厚层与深层肥厚层交界区PCD细胞（40×15）

3　讨　论

　　PCNA是一种Mr 36 000 的细胞核酸性蛋白，是DNA聚合酶δ的辅助因子。PCNA只出现在增殖状态的细胞中，在细胞增殖的S期达到高峰。因此，PCNA阳性着色细胞多少可反映出细胞增殖的状况［3］。表1中可见，胎鼠颞下颌关节髁状突软骨增殖带PCNA 阳性细胞率高达55.3%，表明增殖层软骨细胞增殖能力强，增殖层软骨细胞不断分裂、增殖并向深层移动，使深层软骨细胞得到补充，以保证下颌骨及下颌骨髁状突不断生长发育。进入浅层肥厚层后，虽然PCNA 阳性细胞数减少，但该层软骨PCNA 阳性细胞率仍达到11.9%，表明浅层肥厚层软骨细胞在分化成熟的同时仍具有一定的增殖能力。此点与以往认为的浅肥厚层细胞无增殖能力的观点有所不同。当进入深层肥厚层后PCNA阳性表达消失，说明随着肥厚层软骨细胞分化成熟，软骨细胞逐渐丧失了增殖能力。出生后一周内髁状突软骨PCNA阳性细胞率较胎鼠低，表明出生后颞下颌关节髁状突区生长较胚胎时期减慢。
　　程序性细胞死亡亦称细胞凋亡（apoptosis）是1972 年由Kerr首先提出的一种细胞自我消亡形式。目前已认识到细胞凋亡在胚胎发生、器官发育、肿瘤发生及保持机体的稳态中发挥着至关重要的作用［2］。骨和关节的发育是一个复杂的过程，此间也伴随着PCD。PCD 的紊乱可能导致骨和关节的畸形［4］。最近Matsuda等［5］报道颞下颌关节发育过程中有PCD 的参与，并推测PCD 的异常可能导致先天性髁状突分裂及其它畸形，由此可成为颞下颌关节功能紊乱症(TMD) 及颞下颌关节骨关节疾病(TMJOA) 的病因。
　　本研究显示，胚胎及生后一周颞下颌关节髁状突软骨均有规律性分布的PCD。PCD 阳性细胞主要位于髁状突软骨的增殖层及与深层肥厚层的交界浅层肥厚层中。此结果与Matsuda等［5］用透射电镜观察到的、仅于生后当天出现PCD 不同。一般认为，增殖层是由未分化的间充质细胞构成的，它具有不断增殖、分化为软骨细胞的能力，该区相应出现较高比例的PCD 可控制软骨细胞的数量达到控制生长速度的目的，也可清除快速增殖中出现的异常细胞，保证关节的正常发育。而浅层肥厚层中的PCD 主要出现于邻近深层肥厚层的区域，笔者认为也可能通过PCD 控制浅层肥厚层软骨细胞进一步分化为成熟软骨细胞的数量。从表 1中可见，无论胚胎时期还是出生以后，增殖层的PCNA 的阳性细胞率都明显较PCD 阳性细胞率高，说明细胞增殖量较PCD 量多，二者共同作用的结果是软骨细胞的数量增加，保证了深层软骨细胞得到补充。而进入浅层肥厚层后，PCNA 阳性细胞率转而较PCD阳性细胞率低，说明细胞增殖量较PCD 量少，二者共同作用的结果使软骨细胞数量减少，证明在浅层肥厚层中软骨细胞是以分化、成熟为主。深层肥厚层成熟软骨细胞中PCD 细胞少，充分保证了成熟软骨细胞的数量，有利于合成分泌软骨基质，当邻近骨化端时深层肥厚层软骨细胞衰老，此衰老软骨细胞以PCD 形式被清除，这是骨骼发育的生理性需要。另据Abu等［6］报道，在鸡膝关节的形成的过程中PCD 出现在关节腔形成前，或与其相伴出现，Abu 认为 PCD可能是关节腔形成的因素之一。本实验也发现E14～E15 d关节腔开始形成时关节腔区软骨表面PCD 较其它区域明显，而PCNA 阳性细胞却未见明显增多，提示细胞增殖与PCD 的协调作用共同促使了关节腔的形成及髁状突的塑形。

责任编辑：姚红祥