〔摘要〕　目的：观察和分析细胞程序性死亡(PCD)在细胞凝聚区形成中的作用和意义。方法：建立和制备C57BL/6N系小鼠胚胎期13、14、15、16d和生后10d等多时间点的颌面部发育模型，采用原位末端转移酶标记法标记颌面部组织的PCD细胞。结果：在颌面部骨、牙齿等多种组织器官形成初期都包括间充质细胞的聚集，并出现特定的细胞凝聚区。随着细胞凝聚的出现，PCD的数量和密度增多。当凝聚区内的细胞向特定细胞系表型转化时，PCD数量下降。结论：PCD在颌面部凝聚区的形成中发挥着重要的作用，可控制其中的细胞数量和质量并有利于凝聚区的塑形。
关键词　细胞程序性死亡；干细胞；颌；面部；胚胎

　　目前认为，几乎所有器官的早期形态发生都包括间充质细胞的凝聚和上皮层外形的变化，间充质细胞的凝聚(condensation)是形态发生的关键。如特定骨骼的发生发育取决于该部位凝聚区的形成，成骨性凝聚区的缺陷导致了骨的形态异常［1］。凝聚区的形成过程包括胚胎干细胞的一系列活动，其最终的形成受到多种因素的调控。细胞程序性死亡(programmed cell death，简称PCD)是机体在正常生理状况下的一种细胞死亡，是一种与有丝分裂功能相反的调节细胞群体的方式，PCD在机体发育中发挥着重要的作用。但是，目前对于PCD在细胞凝聚区形成中的作用所知甚少，因此本研究的目的旨在观察和分析PCD在颌面部组织形态发生中在凝聚区形成过程中的作用和意义。

1　材料和方法

1.1颌面部组织发育组织的标本制备　取12周龄，体重25g以上的C57BL/6N系小鼠共21只。雌、雄比例为2∶1，前一天晚8:00雌雄小鼠同笼。次日晨观察雌鼠阴栓情况，有阴栓者为妊娠0d（gestation day0，简称GD0），隔离饲养。分别于妊娠GD13d14h(GD1314，下同)、148、1424、158、1522、168、生后10d共7个时间点各脱颈处死小鼠2只，剖腹取胚鼠。将胚鼠头部与体部于颈部切断后立即将头部置于体积分数为10％中性甲醛固定。经系列常规组织处理后将头部喙部朝下，石蜡包埋，5μm切片，拷干，切片部分进行常规苏木精伊红染色，部分进行PCD的标记染色。主要对于颌面部发育组织中的骨、牙齿、腺体、舌等组织进行观察分析。
1.2PCD细胞的标记　采用原位末端转移酶标记法(TdT-mediated-dUTP nick end labeling，简称TUNEL)标记PCD细胞（ApopTag Plus In Situ Apoptosis Detection Kit试剂盒，简称ApopTag试剂盒，美国Oncor公司产品）。切片常规脱蜡，至蒸馏水，蛋白酶K20mg/L处理15min后加50μl平衡液（ApopTag试剂盒）1min。用含TDT酶反应液的复合液（ApopTag试剂盒）10μl进一步处理30min，A液（0.1mol/LTris-HCl,0.15mol/LNaCl）中漂洗15min，2次。正常血清孵育后加标记碱性磷酸酶的抗地高辛抗体，湿盒内37℃2h。切片于A液和B液（0.1mol/LTris-HCl,0.1mol/LNaCl,0.05mol/LMgCl2）中分别振荡漂洗后，加新鲜配置的显色液（NBT/BCIP显色系统）暗处显色，4h后中止反应。用伊红衬染胞浆，梯度酒精脱水后透明封片。

2　结　果

　　组织学观察显示了颌面部组织器官的发育过程，颌面部骨、关节、牙齿、肌肉（包括舌）等有形组织器官的形成初期都包括间充质细胞或胚胎干细胞的一系列活动，并出现特定的细胞凝聚区。最早出现的凝聚区在下颌突，为下颌骨的始基（图1），GD13d时可见下颌突内未来下颌骨位置的间充质细胞聚集、增殖，并形成一定的形态。采用原位末端转移酶标记法标记PCD细胞，结果显示，在颌面部发育的自始至终都有PCD的出现。GD13d，上、下颌突的发育速度加快，突起内的外胚间充质细胞数量增多，除下颌突内形成凝聚区外，大部分区域细胞的分布仍较均匀，形态一致或相似，其中PCD的数量较少（图2）；而此时下颌凝聚区内的PCD数量明显增多（图3），并持续到骨的生长。在GD15d时，上颌突内也出现凝聚区，可见PCD阳性标记细胞在凝聚区内的密度要高于凝聚区外（图4）。结果显示，在颌骨形成的部位，早期的凝聚区可见数量较多的PCD，而随着凝聚区内细胞向成骨细胞分化，PCD数量渐下降，至骨组织出现时，PCD只保持较低的数量。

责任编辑：姚红祥