摘要　目的:观察兔关节软骨细胞体外培养形成基质能力。方法:通过Ⅱ型胶原酶消化法获得大量高活性兔关节软骨细胞，倒置显微镜及透射电镜下观察细胞形态及超微结构，用含15％胎牛血清的DMEM培养液连续培养，观察软骨基质的形成情况。结果:体外培养的软骨细胞为多角形，透射电镜下见胞浆内有丰富的粗面内质网系统及线粒体,胞膜下及胞浆中有较多分泌泡；连续培养10天时，培养瓶底部出现肉眼可见的白色结节，蕃红-O染色显示白色结节含大量氨基葡聚糖阳性物质，20天时形成火山口样结构，也被蕃红-O染成深红色。结论:软骨细胞在体外也具有很强的基质形成能力并能形成软骨样组织，因而可以用于进行软骨体外再造。
关键词　软骨细胞　基质合成　细胞培养

　　用细胞移植方法进行组织和器官再造，是近年来医学领域的一个重点研究内容，被称为是20世纪的十大科技研究之一［1］。软骨组成成分简单，由细胞和基质构成，不含血管等其他结构。在体外分离、培养软骨细胞，并将细胞种植到具有一定空间结构的三维支架上，通过细胞之间的相互粘附、生长繁殖、分泌细胞外基质，有可能形成具有一定结构和功能的软骨块。本研究观察了培养兔关节软骨细胞的一般形态和超微结构，并通过连续培养的方法观察其体外形成软骨基质的能力，为进一步进行组织再造打下基础。

1　材料和方法

1.1　材料
　　DMEM培养液(Gibco），胎牛血清（FBS，浙江金华清湖犊牛利用研究所），胰蛋白酶（上海浦东生化试剂厂），CO2细胞培养箱（Forma Scientific公司），倒置显微镜及照相系统（Olympus），Ⅱ型胶原酶（Sigma），电子显微镜（JEM-2000 EX透射电镜，JEC公司）。
1.2　方法
1.2.1　软骨细胞的分离、培养
　　1月龄新西兰幼兔1只，耳缘静脉注射空气处死，无菌条件下剪开四肢关节，用刀片切取关节表面软骨，放入盛有DMEM培养液的培养皿中，剪成小碎块，移入25 ml培养瓶中，用培养液洗软骨块两次，加入0．1％Ⅱ型胶原酶2 ml消化20分，轻轻吹打后弃去上清，并重复1次；然后加入0．1％ Ⅱ型胶原酶5 ml，在孵箱内消化6～8小时，其间每隔1小时晃动培养瓶1次，观察大部分软骨块被消化后，轻轻吹打，收集消化液，1000 r/min离心3分使细胞沉淀，用培养液洗两次，以洗去细胞表面的消化酶；细胞记数后移入25 ml培养瓶中，每瓶接种细胞约2×104,加入含10％FBS的DMEM培养液3 ml，置于37℃、饱和湿度、5%CO2的细胞孵箱中培养，每3天换液1次，倒置显微镜下观察并照相，细胞长满后用0.25％胰酶传代。
1.2.2　培养软骨细胞的透射电镜观察
　　取生长良好的第三代细胞，0.25%胰酶消化后移入离心管，3000 r/min离心5分，取出细胞团块用3%戊二醛固定，锇酸后固定，丙酮系列脱水，环氧树脂包埋，切片后进行观察。
1.2.3　软骨细胞体外形成基质的观察
　　取两瓶第三代软骨细胞，用含15％FBS的培养液连续培养，观察培养瓶底部基质形成情况,分别于10、20天取出，95％酒精固定，蕃红-O染色，苏木精衬染，观察基质的形成情况。

2　结　　果

2.1　培养软骨细胞的观察
　　消化6～8小时后，大部分软骨块消失，镜下观察消化液内出现大量小圆形细胞，表明消化成功。软骨细胞贴壁较慢，24～36小时才开始贴壁变形，其外形为多边形，长成一片时呈明显的铺路石状外观，与长梭形的成纤维细胞较易区分（图1）。由于先用胶原酶消化40分，去除了软骨表面的滑膜等结构，可以避免成纤维细胞等细胞成分的污染，因而获得的软骨细胞纯度较高。

图1　培养第二代的软骨细胞，外观呈铺路石状　×200

2.2　透射电镜观察
　　电镜下可见软骨细胞呈合成与分泌功能旺盛的细胞类型，表现为细胞胞浆丰富，核周围有大量的线粒体，粗面内质网发达，胞膜下及胞浆中有较多分泌泡，泡内为合成的基质成分，胞浆中还可见大量成团的糖原颗粒（图2，3）。

责任编辑：姚红祥