图2　透射电镜下，培养的软骨细胞内有发达的粗面内质网和线粒体　×25000

图3　透射电镜下，培养的软骨细胞内有大量分泌细胞　×12000

2.3　基质形成情况的观察
　　传代后的细胞呈单层生长，5～6天时长满培养瓶底部，然后出现叠层生长。镜下见局部密度增高，细胞界限不清。连续培养过程中，软骨细胞聚集成团，培养10天时培养瓶底部可见小的白色结节形成，并不断增大。某些部位形成的基质收缩并大量堆积，形成火山口样结构，其中央又有细胞生长，如此可反复多次，20天时可形成明显的软骨样组织。用蕃红-O进行氨基葡聚糖（GAG）染色，白色结节含大量GAG阳性物质，被染成深红色，软骨细胞被包埋于其中（图4）。火山口样结构也主要由GAG阳性物质和软骨细胞构成(图5)。

图4　连续培养10天，形成类软骨样物质，GAG染色阳性　蕃红-O　×200

图5　连续培养20天，形成火山口样结构，被蕃红-O染成深红色　蕃红-0　×５0

3　讨　　论

　　软骨是主要由氨基葡聚糖、Ⅱ型胶原,和位于陷窝中的软骨细胞构成的富于弹性的组织。软骨组织的自身修复能力很差，而且供区有限，因此各种原因所致的软骨的缺损和畸形，一直是一个临床治疗的难题。目前常用的软骨缺损和畸形修复的方法主要包括自体软骨移植和软骨代用品移植等，但应用时都存在不同程度的问题。
　　George等［2］曾将培养的幼兔软骨细胞悬液注人兔胫骨近心端软骨上直径3 mm，深3 mm的全层缺损中，术后4周，组织学检查见缺损底部有软骨细胞生长，但细胞间质的甲苯胺蓝染色非常淡；术后8周组织学检查仅见缺损底部被软骨细胞覆盖,整个缺损并未得到完全修复。分析其原因，可能是由于大部分软骨细胞未能在缺损中粘附、生长，因此他们提出如果能将软骨细胞接种到一个支架材料上，然后再植入软骨缺损中，修复效果可能会明显提高。Puelacher等［3］将培养的牛软骨细胞接种于聚乙醇酸支架上，然后将此支架-软骨细胞复合物植入裸鼠皮下，成功地形成了软骨组织，并认为这种软骨细胞移植方法为修复关节软骨缺损、耳及鼻翼软骨畸形提供了一种新方法。
　　软骨细胞可在体外培养及增殖，只需要少量的自体软骨细胞，就可获得足够的细胞数量用于移植，因此对自体组织的需要量很少；此外还可以通过冻存的方式，建立软骨细胞库，进行同种异体软骨细胞移植。
　　根据本实验的观察，培养的软骨细胞具有发达的线粒体和粗面内质网，代谢活力高，胞浆中有较多分泌泡，合成及分泌功能旺盛。细胞连续培养时，作者采用高浓度FBS（15％）进行培养，这是由于培养的细胞长成一片时，将会出现接触抑制,而高浓度的FBS可以维持细胞的高活性状态［4］。软骨细胞聚集成灶时，可以分泌形成大量GAG染色阳性物质，肉眼观察在瓶底可见明显的白色结节，细胞包埋于其中，形成软骨样组织，表明细胞在培养瓶中亦具有很强的软骨形成能力。软骨组成成分简单，由细胞和基质构成，不含血管等其他成分，因此，如果将软骨细胞接种在三维支架上进行立体培养，完全有可能在体外条件下形成一块软骨组织，用于移植以修复软骨缺损和畸形。
　　但如何在体外调控软骨细胞的生长、增殖并使其能正常分泌基质，如何建立大规模的软骨细胞培养系统，依然是研究的重点。此外，选用何种支架材料，也是一个需要解决的问题［5］。

作者单位:710032　第四军医大学口腔医学院

参考文献

　1　Langer R，Vacanti JP．Tissue Engineering． Science，1993，260（5110）：920～926
　2　George B， Robert B， Greer C，et al. Homotransplantion of isolated epiphyseal and articular chondrocytes into joint surfaces of rabbits. Nature，1971，230(4969)：385～396
　3　Puelacher WC，Kim SW，Vacanti JP，et al．Tissue-engineered growth of cartilage: the effect of varying the concentration of chondrocytes seeded onto synthetic polymer matrices. Int J Oral Maxillofac Surg，1994，23（1）:49～53

责任编辑：姚红祥