〔摘要〕　目的：探讨cyclinD1及P21cip1/waf1基因表达变化对颞下颌关节发育中髁状突软骨细胞周期活动的影响。方法：用免疫组织化学染色及原位杂交检测mRNA技术，分别对胚胎及生后一周SD大鼠颞下颌关节不同发育时期cyclinD1蛋白及P21cip1/waf1mRNA在髁状突软骨中的表达进行观察。结果：cyclinD1在各发育时期的髁状突软骨增殖层及浅层肥厚层中均有表达，而且从增殖层至浅层肥厚层阳性细胞数无明显变化。P21cip1/waf1　mRNA阳性细胞主要分布于髁状突软骨表面未分化间充质细胞层向增殖层过渡的区域及增殖层深部向浅层肥厚层过渡的区域。结论：P21cip1/waf1在髁状突软骨的特征性分布提示P21cip1/waf1参与软骨细胞周期的调节，P21cip1/waf1表达强弱的变化可能是启动髁状突软骨细胞分化的主要因素之一。
关键词　细胞周期素D1；P21cip1/waf1基因；下颌骨髁状突；关节软骨；细胞周期；胚胎

　　颞下颌关节发育中髁状突软骨是由未分化的间充质细胞聚集、增殖、分化而形成的。髁状突软骨细胞的这一周期变化活动过程理应受内在基因的控制，这一点我们在前期开展的颞下颌关节发育中细胞增殖与凋亡及凋亡相关调控基因方面的研究中得以证实［1］，但是尚未见其它有关报道。本研究旨在通过观察颞下颌关节发育中cyclinD1和P21cip1/waf1基因的表达变化及相互关系，进一步探讨cyclinD1和P21cip1/waf1基因对发育中髁状突软骨细胞周期活动的调控作用。

1　材料与方法

1.1动物模型及标本制备　选用纯系、3月龄SD大鼠(上海产)20只，分别于妊娠13、14、15、16、17、18、19、20d脱颈处死大鼠，切取胎鼠(E)颞下颌关节部置于400g/L的多聚甲醛中固定后常规脱水、石蜡包埋。另取出生后(P)1、2、3、4、5、6、7d幼鼠颞下颌关节部经固定、脱钙后石蜡包埋。作颞下颌关节矢状切片，厚度5μm。
1.2免疫组织化学检测cyclinD1的表达　石蜡切片脱蜡至水，经φ为3%H2O2封闭内源性过氧化物酶及枸椽酸缓冲液微波修复抗原10min后，用正常羊血清封闭30min；加cyclinD1单抗（美国SantaCruz公司产品）置于4℃过夜，室温下复温1h后滴加生物素化二抗37℃反应30min；再加ABC复合物37℃孵育30min，DAB显色后，二甲苯透明、封片。
1.3原位杂交检测Bcl-2基因的表达
1．3．1探针及标记　提取、纯化P21cip1/waf1质粒DNA。P21cip1/waf1探针参照地高辛标记检测试剂盒（Boehringer Mannheim公司）说明书，采用随机引物法标记。
1．3．2P21cip1/waf1mRNA原位杂交　（1）石蜡切片脱蜡至DEPC水，分别用0.2mol/LHCl和20mg/L的蛋白酶K处理，梯度酒精脱水后室温干燥；（2）用地高辛标记探针于42℃杂交后，分别用2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、buffer1、buffer2依次充分洗涤；（3）用体积分数为2%的正常羊血清封闭30min后，滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体孵育2h；（4）经buffer1、buffer3漂洗后，加新配制的显色液(NBT/BCIP显色系统)20μl，暗处显色。中止显色后，梯度酒精脱水，二甲苯透明封片。
1．3．3P21cip1/waf1mRNA阳性细胞计数及统计方法　在光学显微镜下，随机选取5个40×10高倍视野，用10×10网格，分别计数胎鼠髁状突表层（superficial zone，简称S）间充质细胞区、深层（deep zone，简称D）间充质细胞区、增殖层浅部(superficial proliferation zone，简称SP)及增殖层深部(deep proliferation zone，简称LP)中的P21cip1/waf1mRNA阳性细胞数；出生后髁状突表面未分化间充质细胞区消失，故仅计数增殖层浅部及增殖层深部阳性细胞数。计算出胚胎及出生后各组P21cip1/waf1mmRNA平均阳性细胞百分率和标准差，并对前两组及后两组分别进行χ2检验。

2　结　果

2.1cyclinD1免疫组织化学染色　cyclinD1阳性细胞为胞核及核膜着棕黄色，cyclinD1在胚胎及出生后各时期髁状突软骨增殖层及浅层肥厚层中都有表达，而且从增殖层至浅层肥厚层阳性细胞数无明显变化（图1，2），进入深层肥厚层后cyclinD1未见阳性表达细胞。

责任编辑：姚红祥