2.2P21cip1/waf1mRNA原位杂交　P21cip1/waf1mRNA阳性细胞胞浆呈紫蓝色，可见兰色颗粒。胚胎及出生后各时期髁状突软骨中均有P21cip1/waf1mRNA阳性表达。胚胎时期P21cip1/waf1阳性细胞主要分布于髁状突表面未分化间充质细胞向软骨增殖层过渡的区域及增殖层深部向浅层肥厚层过渡的区域（图3，4），进入深层肥厚层后仅在近骨化端处见个别P21cip1/waf1阳性细胞，其余部位均未见阳性表达。出生后P21cip1/waf1阳性细胞主要位于增殖层向浅层肥厚层过渡的区域。各组P21cip1/waf1平均阳性细胞率及χ2检验结果详见表1。

图1　E19d髁状突软骨增殖层与浅层肥厚层中cyclinD1阳性表达细胞（40×15）

图2　P7d髁状突软骨浅层肥厚层至深层肥厚层中cyclinD1阳性表达细胞（40×15）

图3　E19d，髁状突表面深层间充质细胞区P21cip1/waf1mRNA阳性细胞40×15）

图4　E19d，髁状突软骨增殖层深部与浅层肥厚层过渡区P21cip1/waf1mRNA阳性细胞（40×15）

表1　胚胎及出生后各组P21cip1/waf1mRNA阳性细胞率

 (%，±s)

3　讨　论

　　人体从胚胎的发生到组织器官的形成，都是细胞不断增殖、分化、成熟等细胞周期活动的结果。已有大量研究表明，细胞周期是受多层次、多因子、多基因调控的复杂的细胞生命活动，细胞周期及其调控基因的功能异常可成为发育畸形或肿瘤发生的原因。近年来，对影响细胞周期活动的一系列细胞周期素（cyclins）、细胞周期素依赖性激酶(cyclin dependent kinases,CDKs)及细胞周期素依赖性激酶抑制剂(cyclin dependent kinases inhibitors,CDIs)的研究引起了极大的关注。
　　cyclinD1基因定位于11q13，cDNA长4.2kb，可编码是相对分子质量为36000的蛋白。有研究表明cyclinD1蛋白可与cdk4、cdk6结合，其结合物可使pRb（视网膜母细胞瘤蛋白）磷酸化，后者释放出E2F-1转录因子，E2F-1作用于二氢叶酸还原酶等靶基因，使细胞进入增殖状态［2］。本研究结果显示，cyclinD1在各时期髁状突软骨增殖层及浅层肥厚层中均有表达，与发育中髁状突软骨增殖层及浅层肥厚层不断增殖的需要相符。而当进入深层肥厚层后，成熟软骨细胞失去增殖能力cyclinD1表达也消失，说明cyclinD1在软骨细胞增殖过程发挥着积极作用。
　　P21cip1/waf1是CDIs中KIP(kinase inhibition protein)类的成员，P21cip1/waf1基因定位于染色体6p21.2，其cDNA编码164个氨基酸的蛋白质，P21cip1/waf1是目前已知的具有最广泛激酶抑制活性的细胞周期抑制蛋白，它可通过抑制cyclinD1.cdk4、cyclinD1.cdk6、cyclinA.cdk2的蛋白激酶活性，或与DNA聚合酶的辅助因子PCNA结合，覆盖PCNA的功能区，使DNA合成受阻，抑制细胞增殖［2］。从本研究的cyclinD1及P21cip1/waf1的分布特点看，cyclinD1从增殖层至浅层肥厚层阳性细胞数及表达强弱无明显变化，而P21cip1/waf1的表达却有明显的改变。说明在软骨细胞的分化、成熟过程中增殖逐渐停滞并非是cyclinD1表达降低的作用，而是与P21cip1/waf1的表达增加所致。其作用机理可能是P21cip1/waf1抑制cyclinD1.cdk4、cyclinD1.cdk6等蛋白激酶活性的结果。此外，Jernvall等［3］报道，小鼠牙齿发育中P21cip1/waf1的表达不仅与磨牙原发性釉结节上皮增殖停滞与有关，而且还可能与上皮间充质相互作用后细胞的分化有关。Stewart等［5］也报道了P21cip1/waf1在啮齿类动物的生长板软骨细胞中表达水平升高与软骨细胞的肥大化有关。本研究的结果显示，胚胎时期P21cip1/waf1阳性细胞主要分布于髁状突表面未分化间充质细胞向软骨增殖层过渡的区域，及增殖层向浅层肥厚层过渡的区域。胚胎时期由于髁状突软骨形成的需要，未分化的间充质细胞朝着具有定向增殖为软骨细胞功能的增殖层细胞分化，此间深层间充质细胞区P21cip1/waf1阳性细胞率较浅层间质充细胞区高（P<0.01）恰与细胞分化、转型的需要相一致。特别是增殖层深部为增殖层细胞向软骨细胞分化的关键区，P21cip1/waf1在此处的高表达，则更加有力地说明P21cip1/waf1在软骨细胞分化中所起的作用。

责任编辑：姚红祥