〔摘要〕　目的：观察胚胎早期间充质细胞增殖、分化的改变，明确下颌骨在胚胎早期由细胞凝聚到定向分化成成骨细胞而发育形成的过程。方法：用免疫组化及TUNEL染色等方法，检测了胚龄13～19d及出生1d的小鼠下颌骨中未分化间充质细胞增殖、细胞程序性死亡（PCD）及表型转化的生物学改变。结果：胚龄13～15d，间充质细胞开始凝聚形成下颌骨始基并迅速增殖。胚龄16～19d，凝聚区细胞明显向成骨细胞表型转化并开始成骨。麦克尔软骨消失。结论：下颌骨的发育始于胚胎间充质细胞的局部凝聚，大部分细胞经历了快速增殖后逐渐分化成熟，少量细胞出现PCD以清除病变或非必需细胞并与麦克尔软骨的发生及退化有密切关系。
关键词　细胞凝聚；细胞程序性死亡；下颌骨

　　下颌骨是全身骨骼发育中较为特殊的组织，它以早其一步形成的麦克尔软骨为支架，逐渐以膜内成骨的方式发育而成。现代观点认为，细胞凝聚区的形成、演变是胚胎发育早期组织器官形态发生的基础［1,2］。本研究采用C57BL/6N近交系小鼠标本，用增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化、细胞程序性死亡及改良银染色检测方法，探讨了小鼠胚胎早期下颌骨发育中腭突间充质细胞的增殖、分化及程序性死亡的变化。

1　材料和方法

1.1标本制备　见参考文献［3］。
1.2改良银染色　同一编号的切片常规脱蜡至水，在50g/LAgNO3水溶液浸45min，暴露于强光下，蒸馏水漂洗20min，5g/LNa2S2O3.5H2O水溶液消除多余的钙离子，体积分数为0.3％番红花T水溶液衬染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。
1.3免疫组化染色　PCNA单抗购自Dako公司，常规ABC法染色，DAB显色，苏木精衬染。以PBS代替一抗作阴性对照。
1.4TUNEL染色　见参考文献［3］(选同一编号的切片)。
1.5免疫组化、TUNEL染色的结果观察　PCNA的阳性表达为细胞核的棕黄色染色，TUNEL为胞核的蓝色着色。按高倍镜视野（×40）下每100个细胞中阳性细胞所占比例分级。视野中无阳性细胞为“－”；阳性细胞数10％为“＋”；阳性细胞在10％～40％为“＋＋”；视野中阳性细胞>40％则为“＋＋＋”。

2　结　果

2.1HE及Mallory改良银染色　胚胎13d，下颌突间充质细胞密集，胚胎14d，麦克尔软骨形成，其远中间充质细胞凝聚，形态为扁平状。胚龄15d，靠近麦克尔软骨的凝聚区细胞逐渐变为较清楚的立方状且胞核大，胞浆嗜碱性。胚胎16～19d，凝聚区细胞形态多数为立方状，核仁明显，胞浆嗜碱性并可见小片状淡粉色骨基质形成，血管丰富。银染色可见周围有黑色矿化区并逐渐增大。麦克尔软骨中大部分细胞消失，组织结构崩解（图1〕。至出生1d，HE及银染色均显示下颌骨基本形成且矿化良好。
2.2PCNA在小鼠下颌骨及麦克尔软骨发育中的染色结果　胚龄14d，小鼠下颌处始见麦克尔软骨轮廓，其两侧远中分别见一间充质细胞凝聚区，PCNA染色阳性“＋＋＋”（图2）。麦克尔软骨细胞较密集，无明显的软骨细胞陷窝形成，PCNA强阳性着色“＋＋＋”。胚龄15d的切片中可见细胞凝聚区增大，PCNA染色“＋＋”，由边缘向中心，细胞形态逐渐变成立方状且胞核大，麦克尔软骨细胞中PCNA着色“＋＋”，个别细胞胞核已消失。胚龄16d，凝聚区外周细胞PCNA染色“＋”，中心区域细胞胞核大，淡染。麦克尔软骨细胞着色“－”，多数麦克尔软骨细胞胞核消失(图3)。胚龄19d，已无明显的细胞凝聚区，PCNA染色阴性，麦克尔软骨消失。
2.3TUNEL染色在小鼠下颌骨及麦克尔软骨中的染色结果　胚龄14d，凝聚区的间充质细胞“＋”。围绕麦克尔软骨周边的二、三层间充质细胞及软骨细胞TUNEL均为“－”。胚龄15d，下颌骨凝聚区细胞TUNEL“＋”；麦克尔软骨细胞阳性细胞为“＋”（图4〕，少数细胞胞核消失。胚龄16d，凝聚区细胞“＋”；麦克尔软骨细胞“＋”，软骨细胞结构开始崩解。胚龄19d，下颌骨区及麦克尔软骨细胞TUNEL为“－”。

责任编辑：姚红祥