摘要　目的:建立质粒DNA大鼠舌肌表达模型。方法:将表达质粒pM3TnC3、pSV40-LacZ直接注射入Wistar大鼠舌肌中,应用PCR技术、β-半乳糖苷酶(X-gal)组织化学染色及Southern杂交技术分析质粒携带报导基因——乳糖苷酶(LacZ)体内表达情况。结果:PCR结果表明大鼠舌肌纤维具有摄取外源DNA的能力。报导基因表达与质粒DNA注射量及在舌肌中孵化时间相关。注射后24 h可检测出大肠杆菌β-半乳糖苷酶的活性,2个月时仍可检测到。但表达水平在1周时达到高峰。舌肌中共同注射两种表达质粒可在同一横纹肌纤维中同时表达。Southern杂交显示质粒DNA游离于舌肌细胞基因组之外,未发生整合。结论:舌肌中直接注射质粒DNA是一种简便有效的将外源基因转入横纹肌细胞中的方法。舌肌是一个用来分析外源基因表达的理想位点。

　　关键词　质粒　报导基因　舌肌

　　研究已显示小鼠、鱼、猫等一些非灵长类动物的四肢、躯干和心脏的横纹肌纤维具有摄取并表达质粒DNA携带的重组基因的能力［1］。用心肌及四肢肌进行转基因研究通常需要手术暴露肌肉,给转基因操作带来诸多不便。舌肌被覆薄层口腔粘膜,容易接近,为研究外源基因体内表达提供了理想的解剖位点。临床上舌又是一个恶性肿瘤好发区。因此,将舌作为转基因位点进行恶性肿瘤转基因治疗研究亦具有现实意义。
　　本研究探讨了质粒DNA在舌肌纤维中存在的状态及报导基因表达特征。

1　材料和方法

1.1　实验动物
　　Wistar大鼠购于白求恩医科大学动物部,普通饮食喂养。
1.2　表达质粒
　　质粒(plasmid Maori3 TnC3, pM3TnC3)由美国南加州大学Kedes博士惠赠。它是将pMaori3质粒启动子巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)用人肌钙蛋白C快反应基因上游增强子及近端启动子取代构成。其报导基因nLacZ在乳糖苷酶(lactose Z,LacZ)基因3′末端接入一个30 bp编码定位于细胞核内的猴病毒40(Simian virus 40,SV40)大T抗原信号氨基酸及小鼠鱼精蛋白1基因多聚A序列。另一个质粒是pSV40-LacZ,带有SV40病毒早期启动子、大肠杆菌LacZ基因和SV40多聚A。将转有表达质粒的大肠杆菌用LB液体培养基大量培养,采用大规模碱裂解法提取质粒DNA,氯化铯密度梯度法纯化质粒DNA,溶于30%蔗糖溶液中。测定OD260/280值确定质粒DNA浓度。
1.3　质粒DNA注射
　　为分析注射剂量及孵化时间对质粒表达水平的影响,将25、50、100 μg质粒DNA(pM3TnC3或pSV40-LacZ)分别注入4周龄Wistar舌肌中(注射体积为100 μl)。每组注射3只大鼠,另取1只作为对照。对照组动物注射30%蔗糖溶液100 μl。取pM3TnC3及pSV40-LacZ各50 μg,共注射用于分析两种质粒在舌肌中表达情况。另取10只大鼠注射100 μg pM3TnC3用于分析舌肌摄取DNA能力及质粒DNA在舌肌细胞中存在状态。
1.4　舌肌摄取DNA能力分析
　　注射100 μg pM3TnC3的大鼠1周后处死,取舌肌,常规方法提取DNA,溶于TE中。应用PCR技术检测实验组舌肌中大肠杆菌LacZ基因序列。
　　LacZ基因上游引物:+5-GCCGACCGCACGCCGC-ATCCAGC-3。
　　LacZ基因下游引物:+5-TCGCCGCGCCCACTGGT-GTGGGCC-3。
　　PCR产物长1036 bp［2］。PCR反应混合物:10 μg舌肌基因组DNA,50 pmol/L引物,0.2 mmol/L dNTP,1.5 u/50 μl TaqDNA聚合酶。扩增反应为94℃ 30 s,56℃ 1 min,72℃ 1 min,30个循环,72℃保温10 min。1%琼脂凝胶电泳,紫外灯下观察扩增结果。
1.5　β-半乳糖苷酶(X-gal)组织化学染色
　　质粒DNA注射后1 d、1周、4周及8周时处死动物取下舌肌,切成厚3 mm组织片,2%多聚甲醛、0.02%NP-40、0.1 mol/L PBS溶液固定2 h(4℃),X-gal染液中过夜(31.5℃):0.875 g/L NaCl,0.1 mol/L Na2HPO4(pH7.3),2 mmol/L MgCl2,0.01% 脱氧胆酸钠,0.02% NP-40,0.5 mmol/L铁氰化钾,0.5 mmol/L亚铁氰化钾,1 mg/ml X-gal。染色后组织片PBS洗3次,30%蔗糖固定过夜(4℃)。冰冻切片机切取厚约30 μm组织片,乙醇梯度脱水,二甲苯透明,封片,光镜下观察染色结果。

责任编辑：姚红祥