1.6　Southern杂交分析
　　取用于PCR分析的舌肌DNA,用限制性内切酶XbaI酶切,1%琼脂糖凝胶电泳分离。胶中DNA用0.5 mol/L NaOH,1.5 mol/L NaCl溶液变性,用0.5 mol/L Tris(pH7.6),3 mol/L NaCl中和后转移到NC膜上,80℃烤2 h。NC膜在0.25 mol/L Na2HPO4.7H2O,2 ml/L 85%H3PO4,7%SDS溶液中预杂交,65℃,30 min。1036 bp LacZ基因PCR产物纯化后作为探针。探针用随机引物法标记32　P-dCTP。杂交液与预杂交液相同。65℃孵化12 h,2×SSC,0.5%SDS溶液中漂洗65℃,1 h。0.1×SSC中漂洗一次,干燥NC膜后置于暗盒中,加增感屏,-80℃放射自显影。

2　结　　果

2.1　舌肌摄取质粒DNA能力分析
　　采用PCR方法在10只注射100 μg pM3TnC3的大鼠舌肌DNA混合物中均发现1036 bp大肠杆菌LacZ基因序列,对照为阴性。说明舌肌纤维具有摄取外源DNA的能力(图1)。

图1　舌肌摄取质粒DNA分析　M1：1kb DNA标尺，M2：100bp DNA标尺，1：pM3TnC3对照，2～9：实验组舌肌DNA，10：对照组舌肌DNA

2.2　质粒表达与注射量和孵化时间的关系
　　大鼠舌肌分别注射25、50、100 μg pM3TnC3或pSV40-LacZ,注射后1 d组、1周组、4周组和8周组舌肌用X-gal染色检测报导基因的表达。pM3TnC3报导基因染色特征不同于pSV40-LacZ,前者LacZ基因产物定位于细胞核中,沿肌纤维呈线型排列(图2),后者则位于细胞浆中(图3)。所有实验组动物均检测到报导基因的表达,表达可持续8周。但报导基因表达水平在1周时达到高峰。本实验中质粒DNA注射量越大被染色的肌纤维或细胞核数量越多。实验中未观察到两种质粒携带的报导基因表达时间上的差异,说明人肌钙蛋白C快反应基因和SV40启动子均是较强的启动子,在舌肌直接注射外源基因表达研究中具有应用潜力。

图2　pM3TnC3报导基因在大鼠舌肌中的表达，几组肌纤维摄取并表达大肠杆菌nLacZ报导基因，肌细胞核被染成蓝色，呈串珠状排列　X-galL ×66

图3　pSV40-LacZ报导基因在大鼠舌肌中的表达　X-gal ×33

2.3　共注射pM3TnC3和pSV40-LacZ
　　为探讨两种质粒的共同表达情况,作者将pM3TnC3和pSV40-LacZ各50 μg同时注射到大鼠舌肌中,1周后检测报导基因的表达。共表达在同一肌纤维中发现(图4),同时也发现两种质粒在不同肌纤维中分别表达情况(图5)。启动子的强度可根据两种报导基因在同一横纹肌中X-gal染色程度进行比较。

图4　pM3TnC3和SV40-LacZ报导基因在舌肌中共同表达，肌细胞核被染成蓝色，肌浆被染成浅蓝色　X-gal ×33

图5　pM3TnC3和pSV40-LacZ分别在舌肌纤维中表达　X-gal ×33

2.4　质粒DNA在舌肌细胞中存在方式
　　采用Southern杂交技术分析了质粒DNA与舌肌基因组DNA之间的关系,未发现整合现象(图6)。

图6　质粒DN在在鼠舌肌中存在状态Southern杂交分析 M：λDNA Hind Ⅲ标尺,1:pM3TnC3对照,2:对照组舌肌DNA,3～12:实验组舌肌DNA

3　讨　　论

　　作者应用PCR技术证实了大鼠舌肌具有摄取外源DNA能力,表明舌肌与其它肌组织具有相似的摄取外源DNA的能力［3］。
　　基因表达调控研究是一个具有发展前景的领域,因为它具有从分子水平治疗某些疾病的应用潜力［4］。一些转基因技术因此快速发展起来。逆转录病毒载体、腺病毒载体等得到广泛应用［5］。DNA介导的转基因相对简单易行,构建和扩增重组质粒并不复杂。本实验结果表明直接注射法是一种较简便的将外源基因转入舌肌细胞的方法。
　　报导基因产物β-半乳糖苷酶,定位于肌细胞中不同部位。作者利用这一特征观察质粒携带基因表达特点。pM3TnC3表达产物定位于细胞核中,可见到排列成锁链状的蓝色细胞核,表明一组或几组肌纤维吸收并表达外源基因。与之不同,pSV40-LacZ报导基因产物分布于肌细胞浆中,故肌纤维被染成蓝色。这一特点对分析两种具有不同强度启动子的质粒基因表达十分有用。

责任编辑：姚红祥