摘要　目的：观察组织块原代培养法是否可用于涎腺肌上皮细胞发育分化的研究，并探讨肌上皮细胞的组织发生。方法：采用组织块原代培养法，通过相差显微镜、透射电镜及免疫组化染色等检测手段，对不同时期大鼠颌下腺肌上皮细胞进行研究。结果：肌上皮样细胞及含有分泌颗粒的分泌细胞见于体外培养第3d。肌微丝及Actin阳性细胞分别最早出现于培养第6d和7d。此结果与体内研究结果相一致。结论：肌上皮细胞可能来源于上皮干细胞；体外组织块培养方法亦适用于细胞分化研究。
　　关键词　肌上皮细胞　分化　体外培养
　
　　目前，有关涎腺体外原代培养的研究很多，并建立了一些培养方法，但有关涎腺发育分化的体外研究甚少。本实验采用组织块原代培养法，通过相差显微镜、透射电镜及免疫组化染色等检测手段，对胚胎17、18、19、20、21d及生后1、5、10、15、20d大鼠颌下腺肌上皮细胞进行研究。其目的在于：(1)观察组织块原代培养法是否可用于涎腺肌上皮细胞发育分化的研究；(2) 其发育分化是否与体内研究同步；(3)探讨肌上皮细胞的组织发生。

材料与方法
　　一、实验动物
　　选用150～250g健康Wistar雄性和雌性大鼠使之交配，次日晨将雌鼠阴道分泌物涂片，查到精子之日即作为受孕之零日，从此日算起，至胚胎发育17d取出位于胎鼠颈部的颌下腺组织。
　　二、厚胶及薄胶的制备
　　1. 厚胶制备：取大鼠尾腱1g，剪碎，70%乙醇消毒，干燥，溶于1∶1000醋酸，消化，离心，上清用作储存液。厚胶的配制方法为：储存液：10×培养液∶0.34M∶NaOH=8∶1∶1。24孔板内预先放置处理好的盖片，把配好胶铺于其内。
　　2. 薄胶制备：按常规方法制备鼠尾胶原，用吸管将胶原均匀涂于培养瓶生长面的内壁。
　　三、组织块培养法
　　在无菌条件下，取胚胎17天大鼠颌下腺，剪碎至1mm3小块，将小块组织分别接种于预先放置的铺有厚胶或薄胶盖玻片的24孔板中。用含有10%小牛血清、10ng/ml EGF、5μg/ml胰岛素、50ng/ml氢化考地松、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养液培养，37℃，含5%CO2培养箱中培养。
　　四、相差显微镜观察
　　每日用相差显微镜观察大鼠颌下腺上皮细胞生长情况。同时取相应天数生长良好的细胞进行电镜观察及免疫组化染色。
　　五、透射电镜观察
　　无菌条件下，取培养于厚胶上的颌下腺细胞，48h后取出细胞生长较好的盖玻片，定为胚胎17d，依次取出相对应于体内胚胎18、19、20、21d及出生后1、5、15、20d培养的大鼠颌下腺细胞，用2.5%戊二醛固定，常规脱水、包埋、定位、垂直于细胞表面切片、染色、透射电镜观察。
　　六、免疫组织化学染色
　　无菌条件下，取培养于薄胶上的颌下腺细胞。取片情况同电镜观察。固定于甲醇：丙酮(1∶1)溶液中，用特异性抗体肌动蛋白(Actin)，采用ABC法进行免疫组化染色。

结　果
　　一、相差显微镜观察
　　体外培养胚胎17d细胞，48h后可见上皮细胞长出，为多边形或圆形，连接成片，有较多圆形细胞具有核分裂现象。
　　二、透射电镜观察
　　电镜观察提示体外培养细胞发育比体内延迟24～36h。培养3～4d(相对应于体内胚胎18～19d)，肌上皮样细胞出现。核大、不规则。胞浆内见一些球形线粒体和扩张的粗面内质网及具有活力的高尔基复合体。胞浆突少而短。同时出现含有分泌颗粒的腺上皮细胞。培养第6d，肌上皮细胞内可见少量肌微丝、吞饮小泡及丰富的粗面内质网和散在的线粒体，相邻细胞以胞浆突互相相嵌，连接较紧密(图1)。培养第7d，肌上皮细胞胞浆内可见肌微丝束及大量扩张的粗面内质网、线粒体、高尔基复合体及胞膜内侧的吞饮小泡。并在部分区域见到基底板样物。培养第11d，肌上皮细胞数量增加，肌微丝束数量增多。胞浆突细长、弯曲且有分支。培养第16d，肌上皮细胞胞浆内肌微丝明显增多，并可见密体出现。细胞器数目减少。培养第21d，肌上皮细胞内含大量肌微丝束，细胞核形态不规则，吞饮小泡增多，相邻细胞间桥粒数目增加，细胞连接紧密。培养第26d，肌上皮细胞胞浆内含有丰富的肌微丝束，沿细胞长轴分布，细胞器数量减少(图2)。在胚胎发育过程中，尚可见一些形态介于导管和肌上皮细胞之间的细胞。

责任编辑：姚红祥