图1　肌上皮样细胞培养第6天，电镜观　　　　　图2　肌上皮样细胞培养26天，电镜观

　　三、免疫组化染色
　　选用肌上皮细胞特异性的抗体Actin进行免疫组化染色。结果表明，生后1d最早出现Actin阳性细胞，细胞为短梭形，胞核较大，胞浆着色。该细胞数量少且呈弱阳性(图3)。生后15d，Actin阳性细胞明显增多(图4)。生后20d，Actin阳性细胞数量多，有些区域细胞聚集成团，呈强阳性反应。

　　　　　　　　　　
图3　生后1天，Actin阳性肌上皮细胞　　　　图4　生后15天，Actin阳性肌上皮细胞

讨　论
　　体外培养第3d(相当于体内胚胎18d)的颌下腺上皮细胞，电镜下可见肌上皮样细胞及含有分泌颗粒的分泌细胞。培养第6d，肌上皮细胞胞浆内可见少量肌微丝，粗面内质网和较丰富的线粒体。培养第7d，免疫组化染色最早发现Actin阳性细胞。培养21d，肌上皮细胞数量明显增多，肌微丝数量也明显增加。培养第26d，肌上皮细胞数量多，胞浆内含有丰富的肌微丝，免疫组化染色显示肌上皮细胞聚集成团，且呈强阳性反应。Line和Archer［1］的免疫组化研究结果表明，actomyosin阳性细胞最初出现于生后1d。莜原正德［2］通过电镜观察，发现胚胎18d的大鼠颌下腺中可见肌上皮样细胞。胚胎21d和生后1天可见少量的微丝。王洁等［3］免疫电镜研究亦表明Actin在正常肌上皮中为阳性反应。 本研究的结果与他们的观察结果基本一致。且电镜观察与免疫组化染色结果相符，与我们体内研究结果相一致。说明体外组织块培养方法亦适用于细胞分化研究。
　　国外，体外胚胎发育的研究多采用器官培养方法。这样可以更接近体内的发育分化情况。Culter等［4］选用胚胎16天的大鼠颌下腺进行器官培养，观察到肌上皮细胞位于基底膜与腺上皮细胞之间，生长发育情况类似体内，只是比体内延迟24～36h。但器官培养要求较高的培养条件。因此，我们根据现有的条件，采用可促进细胞极性分化且较长时间生存的胶原胶，配合有利于上皮细胞生长的培养液，选用组织块培养法对大鼠颌下腺进行培养。由于培养的组织块是从供体获取后的首次培养，刚刚离体，生物性状尚未发生很大的变化，具有二倍体遗传性。在一定程度上保持其原有组织结构，有利于适应体外环境，上皮与间质可相互诱导，更易反映体内状态。且操作简便，适用于组织量较少的培养，如本实验采用的大鼠胚胎17d颌下腺组织，体积非常小，每个腺体体积仅为约1mm3。只是我们在实验中发现组织块法体外培养的细胞排列的方式不如器官培养那样接近体内。
　　本实验结果显示肌上皮细胞在体外培养时，多位于分泌性上皮细胞之间，以桥粒与分泌性上皮细胞相连。部分区域也可见肌上皮细胞直接与基底板样物接触。Cutler等［5］在培养大鼠颌下腺时可观察到基底板样物的存在。有研究表明肌上皮细胞可产生基底膜成分中的某些蛋白，如层连蛋白、IV型胶原、纤维粘连蛋白等［6］。Warburton等［7］研究结果表明肌上皮细胞和上皮细胞均可产生胶原(主要为IV型胶原)，且肌上皮细胞胶原的产量是上皮细胞的5倍。这些细胞外基质的成份的表达和产生，是由细胞生长的底物所调节的。因此说明细胞周围的间质(如本实验采用的Ⅰ型胶原)可影响基底膜的合成和/或分解［8］。有研究将已出现分支形态但无腺细胞分化的大鼠颌下腺的始基在体外行器官培养，培养液中加入Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原抗体。结果表明所有这些抗体均抑制始基的形态的继续形成和腺细胞的分化，表明间质性胶原(Ⅰ，Ⅲ型)和基底膜胶原(Ⅳ型)在涎腺形态发生中均起重要调节作用［9］。
　　一般胚胎器官发生和细胞的分化是一个连续的过程，提示这两个过程发生的机制具有相关性。然而，器官发生并不限定细胞分化的表型。本实验观察肌上皮细胞的的发育分化也多属于此种情况，观察表明，腺体器官发生和细胞的分化是部分相关的，各自有独立的调控机制。

责任编辑：姚红祥