［摘要］　目的：克隆大鼠骨形成蛋白-2成熟肽编码区基因。 方法：由大鼠成骨肉瘤细胞株（UMR106）中提取细胞总RNA，利用逆转录PCR方法， 从mRNA中扩增出大鼠骨形成蛋白-2成熟肽编码区基因cDNA片段；将获得基因片段插入pGEM-T 质粒中，转化到大肠杆菌JM109后挑选阳性克隆，利用限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定重 组质粒。结果：通过质粒DNA酶切分析及序列测定，我们获得的基因片段为 大鼠BMP-2成熟区cDNA序列。结论：克隆获得大鼠骨形成蛋白-2成熟肽编码 区基因，为表达骨形成蛋白-2提供了前提条件。
［关键词］　大鼠； 骨形成蛋白-2； 基因克隆

　　骨形成蛋白（bone morphogenetic protein BMP）是一种广泛分布于动物骨组织中的酸性蛋 白质，是高效的骨诱导物质，在骨及牙齿的生长和损伤修复中发挥重要作用。BMP属于TGF- β超家族中的一员［1］，其中BMP-2被认为是活性最强的唯一能单独诱导成骨的因 子［2］ 。本文由大鼠UMR106细胞株中获得BMP-2 cDNA成熟区基因片段，并将其克隆到pGEM-T质粒中 ，为表达有活性的BMP-2蛋白奠定基础。

材料和方法

　　1. 用于扩增大鼠BMP-2成熟区基因的两条PCR引物：上游引物为：5′—CACGGATCC CAAGCCAAACACAAACAGCGGAA—3′ ， 5′端插入BamH Ⅰ酶切位点；下游引物为：5 ′—GTGAAGCTTCTAG
CGACACCCACAACCCTCC—3′，5′端插入Hind Ⅲ 酶切位点。
　　2. 试剂
　　载体质粒pGEM-T、总RNA提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、RT-PCR试剂盒，均购于Promega 公司；大鼠成骨肉瘤细胞株（UMR106）由北医口腔颌面外科研究室李盛琳教授惠赠。
　　3. 大鼠成骨肉瘤细胞总RNA提取
　　用含5% FBS 的α-MEM 培养液培养UMR106细胞，0.25%胰酶消化传代培养，收集细胞利用总R NA提取试剂盒提取细胞总RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察RNA提取情况。
　　4. RT-PCR
　　在0.5ml离心管中加入逆转录反应缓冲液，0.2 mM/L dNTP、1μM/L BMP-2 上下游引 物、1μM/L硫酸镁、0.1u/μl逆转录酶AMV、0.1u/μl Tf1 DNA聚合酶、总RNA，在50μl反 应体系中进行RT-PCR；首先在48℃保温45分钟，然后进行PCR扩增，94℃ 30秒、60℃ 40秒 、72℃ 40秒，30个循环后72℃保温5分钟，1%琼脂糖凝胶电泳，观察扩增产物。
　　5. PCR产物的纯化
　　电泳分离RT-PCR扩增产物, 切下363bp PCR产物带(即大鼠BMP-2成熟区应有的cDNA片段 长度)，溶于TE中，利用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。
　　6. BMP-2 片段的扩增
　　用纯化的BMP-2 cDNA 作模板再行PCR扩增94℃ 30秒、60℃ 40秒、72℃ 40秒，30个循 环后72℃保温5分钟，1%琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段纯度；将PCR产物直接用试剂盒进行 纯化。
　　7. 重组体pGEM-BMP-2的构建、转化及筛选
　　载体pGEM-T与纯化的BMP-2 cDNA等摩尔数混合，加入T4 DNA 连接酶室温进行连接，转 化感受态大肠杆菌JM109。将转化菌于含100μg/ml 氨苄青霉素，80μg/ml X-gal 和0.5mM/ L IPTG 的LB 平板上37℃ 孵育过夜,次日,蓝白斑筛选阳性克隆。挑选多个白色单菌落扩大 培养，采用碱裂解法提取pGEM-BMP-2 质粒DNA ，经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ 双酶切，1%琼脂糖凝 胶电泳，鉴定目的基因是否插入pGEM-T中。
　　8. 核苷酸序列分析
　　利用 ABI PRISMTM 377 DNA Sequencer 测序仪进行测序。

结　果

　　1. 细胞总RNA提取
　　总RNA提取试剂盒提取的大鼠UMR106细胞总RNA，电泳未见明显的降解（图1）。
　　2. RT-PCR
　　大鼠UMR106细胞总RNA经RT-PCR扩增后，凝胶电泳可见几条扩增带，但以363bp产物为主 。其它扩增带可能是由于：① 总RNA中混有基因组DNA；② 非特异的扩增（图2）
　　3. 重组质粒pGEM-BMP-2的酶谱分析
　　重组质粒pGEM-BMP-2经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ 双酶切后可见两条带（图3）363bp 的BMP-2 和3003bp 的载体片段。363bp 带与BMP-2 PCR产物电泳带处于相同位置。重组质粒pGEM-BMP -2的酶谱分析与预期的完全一致。

责任编辑：姚红祥