【摘要】　目的　探讨成骨细胞在金黄色葡萄球菌感 染后细胞因子的产生情况。方法　半对数生长期金葡菌6571为实验用 菌株。成骨细胞培养自健康成人下颌第三磨牙拔除术中新鲜去骨块。实验组以MOI为30的比 例感染成骨细胞2小时；对照组未加细菌。在0，2，4，8，12，24，48，72小时收集培养液 ，用ELISA方法测定样本中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8浓度。结果　实验组和对照组均未见TNF-α、IL-1β表达。实验组各时间点IL-6、IL-8浓度明显高于对 照组。结论　成骨细胞在受金葡菌感染后TNF-α、IL-1β、IL-6、IL -8表达上的变化可能有利于机体对骨组织金葡菌感染的清除。成骨细胞可能是减轻金葡菌骨 髓炎的重要细胞成份。
　　【关键词】　成骨细胞　　金黄色葡萄球菌　　细胞因子

　　金黄色葡萄球菌是血源性骨髓炎及骨科植入物感染的主要来源，约 有65%～70%的骨髓炎由金黄色葡萄球菌引起［1，2］。在骨组织中成骨细胞是最重要 的功能细胞，它不但负责骨的形成同时还接受处理骨吸收信号，对破骨细胞的活动有直接作 用［3］。我们曾选择成骨细胞作为目标细胞，探讨它与金葡菌的相互作用。通过研 究证实，成骨细胞在体外能摄入金葡菌，或/和为金葡菌所侵入［4］。这个发现无疑 为金葡菌感染骨组织提供了细胞水平证据，同时也为今后的进一步研究提供了可靠的实验基 础。本文将对成骨细胞在金葡菌感染后细胞因子产生的变化作一初步探讨。

材料和方法

　　细菌培养：选择本实验室标准金黄色葡萄球菌菌株6571用于实验。该菌株保存 在Wilkins-Chalgren琼脂上，于实验开始前2.5小时在Wilkins-Chalgren液体培养基内 培养，并让其生长进入对数生长期。取半对数生长期细菌用于实验，并用分光光度计测定细 菌浓度。细胞经200×g离心10分钟，去上清液，用培养液DMEM(GIBCOL公司)混匀。
　　成骨细胞培养：人成骨细胞培养自健康成人阻生齿拔除手术中的去骨块。成骨细胞培养方法 同Beresford等所采用的方法［5］。将骨块上骨膜及纤维性组织完全剔除，剪成直径 3mm～5mm的细块，用PBS洗去骨髓组织及积血，然后置入75cm3培养瓶内，加入DMEM培养液 (GIBCOL公司)。培养液含25mM Hepes,100单位/ml-100微克/ml的青-链霉素，10%胎牛血清和 2mM L-谷氨酰胺。细胞在37℃、95%空气-5%CO2环境中培养。一旦细胞汇合，即取样用白 细胞碱性磷酸酶试剂盒(Sigma)对细胞进行碱性磷酸酶染色。随机观察100个细胞，碱性磷酸 酶染色阳性率大于80%的细胞进一步培养用于实验，取原代成骨细胞用于侵入实验。
　　成骨细胞感染：将成骨细胞用0.05%胰蛋白酶(GIBCOL公司)处理后，计数，按每孔2×10 5个细胞密度加入6孔培养板中过夜。次日晨于实验开始前更换新DMEM(含0.5%胎牛血 清，余同上述DMEM)。用上述准备好的细菌以MOI为30的比例加入(1个细胞比30个细菌)后置 于摇摆器上，在37℃环境中孵育2小时。2小时后用PBS洗涤成骨细胞2次，然后实验组每孔加 入每毫升含100微克庆大霉素(Sigma)的DMEM(含0.5%胎牛血清)2毫升，以杀灭细胞外残 余细菌，继续在37℃环境中培养。分别在0、2、4、8、12、24、48、72小时收集培养液。样 本保存在-20℃冰箱中备用。对照组不加入金葡菌，阳性对照用10μg/ml脂多糖(Sigma)刺激 成骨细胞，余同实验组。以上实验分三份进行，并重复三次。
　　细胞因子测定：用酶联免疫吸附分析(ELISA)测定样本的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8浓度 。ELISA试剂由伦敦大学免疫实验室提供。操作按说明进行。统计学方法：t检验。

结　　果

　　在三次实验中所有的实验组和对照组样本均未见TNF-α和IL-1β表达。阳性对照 组均可见TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8表达(图1)。两组成骨细胞IL-6和IL-8各时间点浓度 详见表1、表2。

图1　脂多糖阳性对照组细胞因子表达情况

责任编辑：姚红祥