〔摘要〕　目的：应用组织工程学原理，采用温度固化型合成水凝胶作为可注射用软骨的细胞载体，观察软骨的形成情况。方法：从兔耳中分离获取软骨细胞，将软骨细胞与水凝胶溶液混合，混合液的软骨细胞的浓度为50×106/ ml，注射于裸鼠背部皮下组织中，在室温下合成水凝胶由液态变为固态，包被软骨细胞于水凝胶体中。注射后4、8周取材，通过大体标本观察、组织学观察软骨的形成情况。结果：注射后4周在皮下形成稍硬的结节，8周时形成的结节质地坚韧，切面色泽亮白。组织学观察，4周标本中即有软骨形成，但不成熟，8周标本中有成熟软骨形成，番红O染色呈强阳性。结论：温度固化型合成水凝胶作为软骨细胞载体，可以通过注射的方法建造可注射性软骨，具有广阔的应用前景。
关键词　组织工程；软骨；聚合物；水凝胶

　　软骨器官和结构常因先天性和获得性因素引起畸形和缺损。这些疾病在治疗上主要考虑两个问题：其一是选择理想的修复材料；其二是选择创伤小而修复效果好的治疗方法。然而，目前在材料的理想性和适用性方面还远未达到所希望的目标。
　　软骨移植是治疗软骨缺损或畸形的重要方法。在材料的选择上，由于异体和异种软骨尚未解决其移植免疫和细胞活性之间的矛盾，自体软骨仍作为首选材料。随着组织工程的发展，现已能够成功地建造自体软骨组织〔1,2〕。然而，在未来的可适用性上，可注射性软骨具有降低手术难度、减少手术创伤等优点，故特别适用于颌面整形外科、骨科等相关学科〔3,4〕。本实验拟通过组织工程的方法，应用温度固化型合成水凝胶为软骨细胞载体，研究建造可注射性组织工程软骨。

1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　新西兰兔、裸鼠（第四军医大学实验动物研究中心）。
1.1.2　温度固化型合成水凝胶（第四军医大学化学教研室与口腔医学院生物材料室合成）。
1.1.3　Ⅱ型胶原酶（Sigma）, DMEM培养液（Gibco）, 胎牛血清（浙江清湖犊牛利用研究所）
1.2　方法
1.2.1　温度固化型合成水凝胶的制备及特性　使聚氧化乙烯和聚氧化丙烯发生聚合反应，形成聚氧化乙烯-聚氧化丙烯三嵌段共聚物（PEO-PPO-PEO），并对化学键进行修饰，再与丙二醇和水混合，在真空条件下加热促溶。最终使该聚合物在6 ℃以下为牛顿流体， 17 ℃以上为凝胶。消毒后备用。
1.2.2　兔耳软骨细胞的分离和收集　见参考文献〔5〕
1.2.3　软骨细胞/合成水凝胶复合物的形成　在4℃条件下将分离收集的软骨细胞与250 g/L的合成水凝胶充分混合，使软骨细胞的最终浓度为50×106 /ml。在4 ℃条件下暂存备用。
1.2.4　软骨细胞/合成水凝胶复合物的注射　通过12号针头快速将软骨细胞/合成水凝胶复合物注射于3只裸鼠背部皮下组织，每个点注射0.3 ml作为实验组。以单纯注射合成水凝胶和相同浓度的软骨细胞悬液作为对照。
1.2.5　取材与观察　分别于注射后4、8周取材，通过大体标本观察、HE染色、番红 O染色观察软骨的形成和成熟情况。

2　结　果
2.1　大体标本观察　注射后 4 周标本，为皮下组织内的结节，质地稍硬。注射后8周的标本质地坚韧，周围有薄的包膜，剖面为亮白色，与正常软骨相似。软骨细胞悬液注射组也可见软骨样组织形成，但明显小于实验组。单纯注射合成水凝胶组未见软骨组织形成迹象。
2.2　组织学观察　HE染色结果显示，注射后4周标本，局部有大量成活的软骨细胞，可见类软骨组织，番红 O染色呈现弱阳性，表明软骨基质中糖胺多糖的成分较少，形成的软骨还不成熟。注射后8周标本，HE染色可见大量的软骨细胞位于陷窝内(图1)，材料已 被大部分吸收，组织结构类似正常软骨组织，番红O染色为强阳性(图2)，表明形成了 成熟的软骨。细胞悬液注射组也可见软骨形成，但软骨形成量明显少于复合物注射组。 单纯注射聚氧化乙烯水凝胶的标本中未见软骨形成。

图1　注射后8周形成的软骨组织(HE ×40)

责任编辑：姚红祥